【背景和目的】革兰阴性菌的细胞壁的主要成分是脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS),从内到外依次由三部分组成:脂质A(lipid A),核心多糖(core LPS)和O抗原(O antigen)。其中脂质A就是我们通常所说的内毒素,能够导致发热、微循环障碍和休克。核心多糖也参与了部分内毒素的作用。O抗原是脂多糖的最外层部分,由数十个相同的寡糖单位组成,它覆盖在外膜,相当于细菌所穿的一层外衣,它是宿主抗体识别的靶标,它除了决定脂多糖的血清特征外,还保护细菌免遭被宿主细胞吞噬和补体介导的杀伤。鼠疫耶尔森菌是由小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌进化而来的,尤其与假结核耶尔森菌的基因序列高度同源。但是小肠结肠炎耶尔森菌和假结核耶尔森菌表面都有着丰富的O抗原,而鼠疫耶尔森菌恰好是不表达O抗原的。而且鉴于O抗原对细菌的这种保护细菌免遭被外界环境杀伤的作用,我们可以认为O抗原是细菌的一个重要的毒性因子。那么鼠疫耶尔森菌在进化的过程中为什么会丢失这个O抗原毒性因子呢?O抗原的丢失是否与鼠疫菌从导致轻微腹泻的细菌进化为致死性强病原菌有关呢?我们知道HIV感染的致病机制是攻击CD4+T淋巴细胞,但是CD4+T淋巴细胞主要存在于淋巴结,HIV病毒是如何到达淋巴结的呢?前期已经有人研究发现,HIV病毒能够通过其表面的包膜蛋白gp120与树突状细胞表面的受体分子h DC-SIGN相互作用进入抗原提呈细胞内,并劫持抗原提呈细胞,借助抗原提呈细胞向远处游走而得以播散到淋巴结,从而感染CD4+T淋巴细胞。本实验室前期的研究结果表明,某些革兰阴性菌,如大肠杆菌、淋病奈瑟菌、杜克嗜血杆菌、沙门氏菌、鼠疫耶尔森菌,都能够通过core LPS与h DC-SIGN相互作用,促进细菌的黏附和吞噬。由此,我们猜测这些革兰阴性菌可能利用了与HIV感染的相同机制,通过core LPS与h DC-SIGN之间的相互作用劫持抗原提呈细胞,并借助抗原提呈细胞向远处游走而被转运至远处器官造成播散和感染。此外,陈铁教授最早发现大肠杆菌的core LPS能够与h DC-SIGN相互作用促进细菌的黏附和吞噬,而且是core里面的一个特定的寡糖—N乙酰氨基葡萄糖酐(N-Glc NAc)参与了与h DC-SIGN之间的相互作用。因此,后续实验设计中我们用大肠杆菌来作为对照菌株。本研究将观察鼠疫菌O抗原的丢失在促进细菌侵袭宿主细胞并在宿主体内传播中的作用,以及鼠疫菌的core LPS是否也通过与细胞表面分子m DC-SIGN相互作用促进细菌在小鼠体内播散。【方法】1.鼠疫耶耶尔森菌和假结核耶尔森菌O抗原基因序列的比较收集多株鼠疫耶尔森菌和假结核耶尔森菌,并对其合成O抗原的6个基因进行检测,比较这两种细菌O抗原基因的多样性。2.细胞侵袭实验2.1.用表达和不表达O抗原的鼠疫耶尔森菌KIM10(p PCP-,pgm-,p Pst+)以及其core LPS突变株侵袭C57BL/6小鼠的腹腔巨噬细胞,以表达和不表达O抗原的大肠杆菌作为对照,利用庆大霉素保护实验观察细菌感染细胞两小时后O抗原对鼠疫耶尔森菌侵袭巨噬细胞的影响。2.2.用不表达O抗原的鼠疫耶尔森菌KIM10分别侵袭表达各种不同细胞表面分子的CHO细胞,以假结核耶尔森菌和core LPS暴露的大肠杆菌作为对照,寻找具体能够与鼠疫耶尔森菌core LPS结合的具体细胞表面分子是否为DC-SIGN。2.3.获得core LPS突变的鼠疫耶尔森菌再次重复细胞侵袭实验,观察core LPS突变后鼠疫耶尔森菌对侵袭细胞的能力是否会降低。3.细胞侵袭抑制实验3.1.用特异性的抗细胞表面分子抗体以及受体分子和配体分子的类似物与细菌相互作用之后再次进行细胞侵袭实验,以此确定鼠疫耶尔森菌的core LPS能够特异性与相应的细胞表面受体分子结合。4.动物感染体外实验4.1.通过腹腔注射细菌悬液感染C57BL/6小鼠,1.5h后收集小鼠腹腔巨噬细胞,利用庆大霉素保护实验,观察有无O抗原的鼠疫耶尔森菌侵袭小鼠腹腔巨噬细胞的情况。5.动物感染体内实验5.1.模拟腺鼠疫感染途径,用适当剂量的有无O抗原的鼠疫耶尔森菌1418(p PCP1+,pgm-,p Pst+,此菌含有毒性大质粒,为生物安全二级,对人不致病,但大剂量可致小鼠死亡)经足垫感染C57BL/6小鼠,观察感染2天后细菌在小鼠体内的分布情况。5.2.构建表达荧光质粒PXEN-18的鼠疫耶尔森菌1418 PXEN-18/1418 O+PXEN18,并经足垫感染C57BL/6小鼠模拟腺鼠疫感染途径,利用活体成像系统定期观察有无O抗原的鼠疫耶尔森菌在小鼠体内的播散情况。5.3.分别经足垫注射和尾静脉注射模拟腺鼠疫和系统性鼠疫感染途径感染C57BL/6小鼠,观察有无O抗原的鼠疫菌1418对小鼠死亡情况的影响。【结果】1.假结核耶尔森菌可能再次丢失O抗原进化出新的鼠疫耶尔森菌的分支选取国内外5株鼠疫耶尔森菌和45株假结核耶尔森菌,对其合成O抗原的基因进行测序,发现鼠疫菌的O抗原基因相对稳定,在5株鼠疫菌株中均能检测到。但假结核耶尔森菌只有部分菌株编码O抗原的基因能够检测到,部分菌株的O抗原基因是缺失的。这说明假结核耶尔森菌可能再次丢失O抗原进化出新的鼠疫菌的分支,在全球社会环境动荡的条件下,可能会发生第四次大流行。2.O抗原覆盖鼠疫耶尔森菌的core LPS能够抑制细菌对巨噬细胞的侵袭作用与不表达O抗原的鼠疫耶尔森菌KIM10相比,转化有O抗原基因的鼠疫耶尔森菌KIM10 O+以及将核心多糖的外核切掉的鼠疫菌KIM10 core-对小鼠腹腔巨噬细胞的侵袭能力明显降低,鼠疫耶尔森菌丢失O抗原后其侵袭能力增加。结果说明O抗原的表达能抑制鼠疫耶尔森菌对细胞的侵袭,而鼠疫耶尔森菌的core LPS可能是细胞表面分子的配体。3.m SIGN-R1是鼠疫耶尔森菌的core LPS的受体用表达m DC-SIGN,m SIGN-R1,m SIGN-R3,m DEC205,m Langerin等能够与鼠疫耶尔森菌相互作用的细胞表面分子的CHO细胞与core LPS暴露的鼠疫耶尔森菌相互作用,发现细菌对CHO-m SIGN-R1细胞的侵袭能力最强。而且这种吞噬作用能够被抗m SIGN-R1抗体和肝素多糖和甘露聚糖等分子抑制。结果说明m SIGN-R1是鼠疫耶尔森菌core LPS的特异性受体。4.core LPS的暴露能够促进细菌在宿主体内播散通过对感染细菌后的小鼠内脏中的细菌数目计数,不表达O抗原的鼠疫耶尔森菌肝脏和脾脏中的细菌数量要多于表达O抗原的鼠疫菌。活体成像结果显示不表达O抗原的鼠疫菌能迅速从接种部位播散至肝脏和脾脏,而表达O抗原的鼠疫菌在相同时间内从接种部位播散到远处脏器的细菌量要明显少于不表达O抗原的鼠疫菌。通过足垫接种鼠疫耶尔森菌模拟腺鼠疫,1418和1418O+均能导致小鼠死亡,但是不表达O抗原的鼠疫耶尔森菌感染后,小鼠生存期更短,死亡率更高。以上结果说明鼠疫菌O抗原的丢失促进了core LPS的暴露并与细胞表面受体结合,进而促进了细菌侵袭宿主细胞并在宿主体内播散。【总结】本研究证明了鼠疫耶尔森菌的core LPS与m SIGN-R1互为配齐、受体,而且鼠疫耶尔森菌可以通过此二者之间的相互作用促进细菌在宿主体内的播散。【背景和目的】ail基因存在于耶尔森菌属染色体基因组中,编码一种17KDa的蛋白质。Ail蛋白属于外膜蛋白(outer membrane proteins,OMP)家族成员,其作用是抵抗补体介导的杀伤作用,促进对宿主细胞的侵袭和粘附以及巨噬细胞内存活,帮助Yop蛋白进入宿主细胞抑制宿主的免疫应答。目前所知道的是鼠疫耶尔森菌的ail基因与假结核耶尔森菌的ail基因具有高度同源性,相似度高达99%。但是二者的致病性却不完全相同,有研究显示ail基因在鼠疫菌中的黏附和侵袭细胞的能力要远大于在假结核耶尔森菌中的作用。我们知道,病原菌感染宿主的首要关键步骤是粘附和侵袭上皮细胞。对于假结核耶尔森菌而言,此步骤是必须的,因为假结核耶尔森菌需要主动粘附和侵袭宿主肠道上皮细胞才能导致后续的肠道感染。但是此过程对于鼠疫耶尔森菌而言则是不必要的。因为鼠疫菌感染人的传播途径目前公认的只有两种,一种是经过跳蚤叮咬引起腺鼠疫,另一种是经过呼吸道传播引起肺鼠疫。其中腺鼠疫是公认的最原始的感染形式。但是在腺鼠疫感染途径中,人类感染鼠疫菌是通过跳蚤的叮咬而进行传播的,细菌由此而直接进入宿主体内,完全替代了ail基因的粘附和侵袭功能。那么为什么鼠疫耶尔森菌会保留ail基因的功能,并且还对Ail蛋白功能进行了优化呢?我们推测口鼠疫才是鼠疫菌感染的最初形式,腺鼠疫和肺鼠疫是后来在口鼠疫的基础上发展而来的。因为假结核耶尔森菌造成消化道感染需要ail基因的粘附和侵袭宿主上皮细胞的作用,有可能鼠疫菌遗传假结核耶尔森菌的ail基因的粘附和侵袭功能是为了通过消化道去感染人。有研究表明,假结核耶尔森菌的ail基因有利于细菌在小鼠肺组织定植。因此,我们认为鼠疫耶尔森菌保留了ail基因的功能其作用并不在于腺鼠疫,而主要在于造成口鼠疫和肺鼠疫感染,ail基因能够促进鼠疫耶尔森菌在口鼠疫和肺鼠疫小鼠模型中的播散,并且ail的这种促进细菌播散的作用主要来自ail基因的粘附和侵袭宿主的功能。【方法】1.构建表达和不表达Ail的鼠疫耶尔森菌以及表达荧光质粒PXEN-18的鼠疫耶尔森菌1.1.利用自杀质粒和蔗糖筛选的办法构建缺失ail基因的鼠疫耶尔森菌1418Ail(-)以及1418PYV(-)Ail(-)。1.2.用1418作为阳性对照进行PCR检测ail基因是否成功敲除,用血清抵抗实验进一步验证ail基因敲除后其功能是否缺失。1.3.用电转或者化学转化的方法将荧光质粒构建到鼠疫耶尔森菌1418以及1418Ail(-)中,以获得表达荧光质粒的鼠疫耶尔森菌1418PXEN-18以及1418Ail(-)PXEN-18,用以做活体成像实验。2.动物感染实验2.1.通过不同的感染途径给C57BL/6小鼠接种适当剂量的鼠疫耶尔森菌1418和1418Ail(-)模拟肺鼠疫、腺鼠疫、胃鼠疫和系统性鼠疫,观察小鼠的死亡情况。2.2.通过点鼻吸入,足垫注射,灌胃以及尾静脉注射鼠疫耶尔森菌1418和1418Ail(-)模拟肺鼠疫,腺鼠疫,胃鼠疫和系统性鼠疫,观察感染早期阶段细菌由接种部位转移至其他脏器的播散情况。2.3.同样采用以上四种感染途径给C57BL/6小鼠接种鼠疫耶尔森菌1418PXEN-18和1418Ail(-)PXEN-18,在一定时间内通过活体成像系统进一步直观的观察细菌在小鼠体内的播散情况。3.细胞侵袭实验3.1.用鼠疫耶尔森菌1418PYV(-)以及1418PYV(-)Ail(-)感染中国仓鼠卵巢上皮细胞(CHO)和C57BL/6小鼠腹腔巨噬细胞,利用庆大霉素保护实验观察感染两小时后细菌对细胞的侵袭能力有无区别。【结果】1.构建好的鼠疫耶尔森菌存在相应的ail基因功能缺失,并含有对应的荧光质粒以鼠疫耶尔森菌1418煮沸后的上清液模板作为阳性对照,PCR实验结果显示用自杀质粒构建的ail基因突变株鼠疫耶尔森菌无法扩增出相应的条带。用针对荧光质粒PXEN-18的引物对成功转化了荧光质粒的鼠疫耶尔森菌进行PCR能够得到相应的PCR产物。血清抵抗实验表明敲除ail基因的鼠疫耶尔森菌失去了抵抗人的血清中补体的杀伤作用的功能。以上结果均说明ail缺失的鼠疫耶尔森菌突变株构建成功。2.ail基因在肺鼠疫和胃鼠疫中有促进细菌播散的能力用适当剂量的鼠疫耶尔森菌1418和1418Ail(-)感染C57BL/6小鼠后观察到,在肺鼠疫感染途径和胃鼠疫感染途径中,ail基因敲除的鼠疫耶尔森菌导致的小鼠死亡时间延长,相同剂量的鼠疫耶尔森菌1418Ail(-)导致的小鼠死亡数量也比1418少。而在腺鼠疫和系统性鼠疫模型中,二者所导致的小鼠死亡率区别不大,仅只有ail基因敲除的细菌导致的小鼠死亡时间比1418稍微推迟。通过分离以及研磨感染细菌后的小鼠内脏并对研磨液涂板和计数细菌的数量观察感染早期小鼠各脏器中细菌的分布情况发现,在肺鼠疫和胃鼠疫模型中,鼠疫耶尔森菌1418能迅速从接种部位播散至其他脏器(如淋巴结、肝脏、脾脏、肺脏等),而ail基因敲除的菌株从接种部位播散至远处器官的能力要比1418弱。对于腺鼠疫和系统性鼠疫,则二者的播散能力区别不大,仅有细微区别,但是不具统计学意义。用构建好的带有荧光质粒的鼠疫菌经以上四种感染途径感染小鼠后,通过活体成像系统直观的观察细菌在小鼠体内的播散情况,结果基本符合上述解剖感染后的小鼠取内脏研磨液涂布平板的结果。在感染早期的肺鼠疫和胃鼠疫模型中,能明显观察到鼠疫耶尔森菌1418在小鼠体内有荧光信号,而1418Ail(-)组小鼠则检测不到荧光信号。在腺鼠疫和系统性鼠疫模型中,都能检测到相应的荧光信号,虽然1418组小鼠荧光信号稍强于1418Ail(-)组,但是区别并不明显,没有统计学意义。以上结果说明,Ail蛋白在肺鼠疫和胃鼠疫中促进细菌播散的能力要远大于在腺鼠疫和系统性鼠疫中的播散能力。这可能与Ail蛋白能帮助细菌突破宿主上皮细胞的侵袭能力有关。3.Ail蛋白具有侵袭上皮细胞的能力通过用鼠疫耶尔森菌1418PYV(-)和1418 PYV(-)Ail(-)感染中国仓鼠卵巢上皮细胞发现,ail基因敲除的细菌对细胞的侵袭能力要明显低于野生株。这提示,ail基因能够增强细菌在肺鼠疫和胃鼠疫中的播散能力源于ail基因对上皮细胞的侵袭能力。【总结】本研究证明了鼠疫耶尔森菌的Ail蛋白能够通过对宿主细胞的粘附和侵袭作用促进细菌在小鼠肺鼠疫和口鼠疫模型中的播散。