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随着社会经济发展和人们生活方式的改变,人类疾病谱正在发生变化,慢性肾脏病(CKD)已呈现流行特征,并成为21世纪全球性的公共卫生问题。CKD一旦发展为终末期肾脏病(ESRD),则必须依赖肾脏替代治疗(RRT),即血液透析、腹膜透析、或肾移植来维持生命,给患者家庭及社会带来沉重的经济负担和社会压力。因此,早期诊断及防治慢性肾脏病有着特殊重要的意义。研究表明,肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),尤其是血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)在CKD的发生和进展中发挥重要作用。AngⅡ是RAAS系统最主要的效应分子,业已证实AngⅡ不仅通过改变肾小球血流动力学促进肾小球硬化,还可促进系膜细胞、内皮细胞和肾小管上皮细胞增生、生长因子表达及细胞外基质积聚。Ang Ⅱ的作用是通过与Gq蛋白偶联的Ⅰ型血管紧张素受体(AT1受体)完成的,而AT1受体为跨膜糖蛋白,本身不具有酪氨酸激酶(此酶介导有丝分裂的细胞信号)活性,也不直接与酪氨酸激酶发生联系。本研究将深入探讨Ang Ⅱ介导肾小球系膜细胞增殖及炎症介质的表达的信号转导机制,这不仅有助于加深人们对CKD发病机制的认识,同时也为未来CKD治疗策略的制定提供理论依据。
本研究包括两部分内容:
一、c-Jun氨基末端激酶介导血管紧张素Ⅱ诱导的人肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达
目的:AngⅡ可诱导体外培养的系膜细胞c-Jun氨基末端激酶(JNK)活化,但其活化后的生物学意义仍不清楚。本研究选用新型的JNK特异性阻断剂SP-600125,探讨JNK-c-Jun/AP-1信号通路在Ang Ⅱ诱导的肾小球系膜细胞增殖及炎症介质表达中的作用。
方法:体外分离培养人肾小球系膜细胞,应用SP-600125预处理后加入AngⅡ刺激,应用Western Blot检测JNK、细胞外调节蛋白激酶(ERK1/2)和p38的活性以及c-Jun磷酸化;应用荧光素酶(Luciferase)活性检测法检测c-Jun转录活性及单核细胞趋化蛋白(MCP-1)启动子活性;凝胶电泳迁移率(EMSA)检测活化蛋白-1(AP-1)DNA结合活性;核酸酶保护法检测MCP-1 mRNA表达;ELISA检测培养上清中MCP-1、转化生长因子(TGF-β1)和纤维连接蛋白(FN)的分泌;3H-胸腺嘧啶(3H-TdR)掺入法和细胞计数法测定系膜细胞的增殖。
结果:1.AngⅡ可呈时间依赖性和剂量依赖性的方式诱导JNK活化及c-Jun磷酸化,100 nmol/L Ang Ⅱ刺激15 min后,c-Jun磷酸化显著增加,JNK活性明显上调,30分钟达到高峰,是对照组的6.2倍,1 h后几乎恢复到正常水平。
2.JNK特异性抑制剂SP-600125呈剂量依赖性的方式抑制Ang Ⅱ诱导的JNK活化和c-Jun磷酸化,当浓度为10μmol/L和20μmol/L时其抑制作用分别达75%和90%,SP-600 125对ERK1/2和p38 MAPK磷酸化水平均无抑制作用。
3.AngⅡ刺激后c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性显著增加,SP-600 125可呈剂量依赖的抑制Ang Ⅱ诱导的c-Jun转录活性及AP-1 DNA结合活性的增加,20μmol/L SP-600125预处理几乎完全阻断c-Jun的反式激活。4.AngⅡ显著增加MCP-1启动子活性及MCP-1 mRNA表达,SP-600125可呈剂量依赖性的抑制Ang Ⅱ诱导的MCP-1启动子活化和MCP-1 mRNA表达以及系膜细胞MCP-1、TGF-β和FN的分泌。5.1~20 μmol/L SP-600125以剂量依赖的方式抑制Ang Ⅱ促进的系膜细胞3H-TdR掺入量和细胞计数的增加,而MEK1/2特异性抑制剂PD-98059和p38 MAPK特异性抑制剂SB-203580对Ang Ⅱ诱导的系膜细胞数目的增加无抑制作用。
结论:Ang Ⅱ→JNK/SAPK→c-Jun/AP-1信号通路在系膜细胞增殖和炎症介质分泌中发挥一定的作用。JNK特异性抑制剂SP-600125能部分抑制Ang Ⅱ诱导的系膜细胞增殖和炎症介质分泌。
二、血管紧张素Ⅱ通过Ros/EGFR/JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖
目的:我们前期的研究发现Ang Ⅱ可通过JNK/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖,但JNK/AP-1活化的上游通路尚不清楚。本研究探讨活性氧(ROS)和表皮生长因子受体(EGFR)在Ang Ⅱ诱导的JNK/AP-1活化及系膜细胞增殖中的作用并探讨ROS释放的来源。
方法:体外培养人肾小球系膜细胞,应用3H-TdR掺入法和细胞计数测定系膜细胞增殖;荧光探针2,7-二氯二氢荧光素乙酰乙酸(DCFDA)检测细胞内ROS产生;化学发光法检测尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)氧化酶活性;实时定量RT-PCR检测NADPH亚基p47phox和p67phox mRNA表达;Western Blot检测p47phox和p67phox膜转位以及EGFR、JNK和c-Jun磷酸化。
结果:1、Ang Ⅱ呈时间依赖性和剂量依赖性促进肾小球系膜细胞ROS产生。Ang Ⅱ刺激3 min,系膜细胞内ROS产生明显增加,至60 min达到高峰,系膜细胞ROS产生是对照组2.26倍;1、10、100nmol/L Ang Ⅱ刺激60 min,ROS产生分别是对照组的1.82、2.92和4.08倍。AT1受体(AT1R)拮抗剂losartan完全阻断了Ang Ⅱ诱导的ROS产生,而AT2受体(AT2R)拮抗剂PD123319无抑制作用。2、NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI几乎完全阻断Ang Ⅱ诱导的ROS产生,而线粒体complex Ⅰ抑制剂鱼藤酮(rotenone,ROT)、黄嘌呤氧化酶抑制剂别嘌呤醇(allopurinol,ALLO)、环氧化酶抑制剂吲哚美辛(indomethacin,INDO)、脂氧化酶抑制剂(nordmydroguiaretic acid,NDGA)、细胞色素P450氧化酶抑制剂酮康唑(ketoconazole,KETO)以及一氧化氮合成酶抑制剂N-硝基-L-甲酯精氨酸(NG-nitro-L-arginine methyl ester,L-NAME)对Ang Ⅱ诱导的ROS产生均无明显影响。Ang Ⅱ显著刺激NADPH氧化酶活化及p47phox和p67phox膜转位。3、Ang Ⅱ可呈时间依赖性和剂量依赖性诱导系膜细胞EGFR磷酸化,100 nmol/L Ang Ⅱ刺激30 min,EGFR磷酸化达到高峰,是对照组的3.96倍;AT1受体阻断剂losartan、抗氧化剂乙酰半胱氨酸(NAC)以及NADPH氧化酶抑制剂apocynin和DPI著抑制Ang Ⅱ诱导的EGFR磷酸化,同时EGFR拮抗剂AG-1478几乎完全阻断Ang Ⅱ诱导的系膜细胞增殖。4、Losartan、NAC、apocynin、DPI和AG-1478阻断Ang Ⅱ诱导的JNK/AP-1活化和系膜细胞增殖。
结论:ROS/EGFR/JNKYAP-1信号通路参与Ang Ⅱ诱导的。肾小球系膜细胞增殖。NADPH氧化酶抑制剂和EGFR受体拮抗剂能显著抑制Ang Ⅱ诱导的系膜细胞增殖,可能具有一定的治疗作用。
本研究创新之处在於:
1.首次发现:Ang Ⅱ可通过JNK-c-Jun/AP-1信号通路诱导肾小球系膜细胞增殖和MCP-1、TGF-β以及FN表达(参见:ZhangA,Ding G,Huang S,Wu Y,Pan X,Guan X,Chen R,Yang T.c-Jun NH2-temainal kinase medimionof angiotensin Ⅱ-induced proliferation of human mesangial cells Am J PhysiolRenal Physi01.2005;288:F111 8-1124)。
2.首次发现:活性氧依赖的表皮细胞生长因子受体磷酸化介导Ang Ⅱ诱导JNK-c-Jun/AP-1信号通路活化及肾小球系膜细胞增殖(参见:Ding G,Zhang A,Huang S,Pan X,Zhen G ,Chen R,Yang T.ANG Ⅱ induces c-JunNH2-terminal kinase activation and proliferation of human mesangial cells viaredox-sensitive transactivation of the EGFR.Am J Physiol Renal Physiol.2007;293:F1889-1897)。