附子(Aconitum carmichaeli Debx.)为“热性”中药的典型代表,本课题组前期以生物体的能量代谢为切入点,以能量-物质-信息转换为主线,以多研究模型(大肠杆菌、金葡菌、四膜虫和脾淋巴细胞),基于生物热动力学方法(冷热板示差法和微量量热法),系统刻画了附子干姜配伍、附子不同炮制品、不同产地附子、附子不同提取部位等对模型生物能量代谢的影响特征,初步证实了“附子无干姜不热”和附子“热性”的客观真实性。基于以上研究基础,本研究首次选取切实关联能量代谢的肝脏线粒体为研究模型,采用以微量量热法并结合UPLC-MS分析和网络药理学方法,系统考察不同产地附子(四川江油、云南布拖、陕西汉中、湖南娄底、湖北恩施和贵州铜仁)、附子不同炮制品(生附子、盐附子、黑顺片、炮天雄、炮附子和白附片)和毛茛科乌头属不同药材(川乌、草乌和雪上一枝蒿)对线粒体代谢影响差异的规律,以进一步证实附子类药材“热性”的客观真实性,并探讨其物质基础和作用机制。主要研究结果如下：1附子类药材的化学成分分析以高效液相色谱(HPLC)为检测方法,针对附子类药材中3种双酯型生物碱(即乌头碱、次乌头碱和新乌头碱)和3种单酯型生物碱(即苯甲酰新乌头原碱、苯甲酰次乌头碱和苯甲酰新乌头碱)的含量进行分析。含量测定和层状聚类分析(HCA)结果显示,附子不同样品中各成分的含量差距明显,并且不同产地生附子、附子不同炮制品和毛茛科乌头属不同来源植物均可较好地聚为一类,提示附子的产地、炮制和来源是影响成分含量差异的重要因素。以上结论为文后生物热动力学和质谱的“谱-效”相关分析提供了实验依据和数据参考。2建立了基于线粒体能量代谢的生物热动力学方法选取直接契合能量代谢过程的肝脏线粒体为研究模型,建立基于线粒体能量代谢的生物热动力学方法,用于表征附子类药材的“热性”差异。本实验系统考察线粒体来源和线粒体浓度,并进行方法学考察。实验结果显示,该方法中线粒体的来源为SD大鼠最佳,最佳实验浓度为4.0 g/L；方法学考察结果提示该方法精密度、重复性均符合实验要求3不同产地附子对线粒体“热性”差异的生物热动力学及物质基础研究采用微量量热法考察不同产地附子对大鼠肝脏线粒体生长代谢的影响,并总结其促进线粒体生长代谢的作用规律：即在不同浓度的样品的作用下,线粒体代谢情况随浓度的变化出现规律性改变,当样品浓度较低时,样品均能促进线粒体的代谢,表现为热力学参数k、Pmax、Q和Pav上升,而Tlag、Tmax均有一定程度的降低；但当样品的浓度到达一定量时,线粒体的生长代谢受到抑制,表现为线粒体生长代谢的热力学参数Tlag、Tmax、K、Pmax、Q和Pav均表现为降低。提示附子对线粒体的生长代谢具有“促进／抑制”双重作用。采用主成分分析(PCA)抽提主要的热动力学参数,结果显示Pmax可用于表征药物促进线粒体代谢效率的评价指标。以Pmxa为计算不同产地附子样品促进线粒体50%代谢效率(EC50)的指标,得不同产地附子样品促进线粒体产热强度规律为：四川江油>云南布拖>陕西汉中>湖北恩施>贵州铜仁>湖南娄底,EC50分别为1.86、1.96、2.12、 2.48、3.23、4.41mg/mL。以上结果提示不同产地附子“热性”差异客观存在。选取不同产地附子对线粒体生长代谢影响的主要热动力学参数Pmax作为效能组变量,选取UPLC-MS研究中37个目标成分的峰面积作为化学组变量进行典型相关分析(CCA)。筛选出不同产地附子对线粒体生长代谢影响的强弱主要受16-hydroxycardiopetaline、Carmichaeline、Isotalatizidine、14-acetykarakoline、 Talatisamine、SenbusineB、SenbusineA、Neoline、Hypaconine、Mesaconine、 Dehydrated benzoylmesaonitine、Benzoyl Hypaconitine、Benzoyldeoxyaconine、 Benzoyl Mesaconitine、Delphinine、Benzoyl Aconitine、Mesaconitine共17个成分的影响,即不同产地附子“热性”差异的物质基础。4附子不同炮制品对线粒体“热性”差异的生物热动力学及物质基础研究采用微量量热法考察附子不同炮制品对大鼠肝脏线粒体生长代谢的影响,结果显示,其促进线粒体生长代谢的作用规律与不同产地附子规律相似(炮天雄、白附片除外)。PCA结果显示k和Q可用于表征附子不同炮制品促进线粒体代谢效率的评价指标。以k为计算附子不同炮制品样品促进线粒体50%代谢效率(EC50)的指标,得附子不同炮制品促进线粒体产热强度规律为：生附子>炮天雄>黑顺片>炮附子>盐附子>白附片,EC50分别为0.51、1.01、1.18、1.45、1.47、1.95 mg/mL。以上结果提示附子不同炮制品“热性”差异客观存在。选取主要热动力学参数k和Q作为效能组变量,选取37个目标成分的峰面积作为化学组变量进行CCA分析。确认附子不同炮制品对线粒体生长代谢影响的强弱主要受16-hydroxycardiopetaline、Isotalatizidine、Talatisamine、SenbusineA、 SenbusineB、Neolie、Fuziline、Mesaconine、Dehydrated benzoylmesaonitine、 14-anisoylneoline、Benzoyl Hypaconitine、Benzoyldeoxyaconine、 Benzoyl Mesaconitine、Delphinine、 Benzoyl Aconitine、14-benzoyl-10-OH-aconine、 Mesaconitine共17个成分的影响,即附子不同炮制品“热性”差异的物质基础。5毛茛科乌头属药材对线粒体“热性”差异的生物热动力学及物质基础研究采用微量量热法考察毛莨科乌头属药材对大鼠肝脏线粒体生长代谢的影响,结果显示,其促进线粒体生长代谢的作用规律与不同产地附子作用规律相似(川乌除外)。PCA结果显示Pmax和Q可用于表征药物促进线粒体代谢效率的评价指标。以Q为计算毛茛科乌头属药材促进线粒体50%代谢效率(EG0)的指标,得毛莨科乌头属药材促进线粒体产热强度规律为：草乌>雪上一枝蒿>川乌,EC50分别为1.61、2.31、1.10 mg/mL。以上结果提示毛莨科乌头属药材“热性”差异客观存在。选取主要热动力学参数Pmax。和Q作为效能组变量,选取37个目标成分的峰面积作为化学组变量进行典型相关分析。确认了毛莨科乌头属药材对线粒体生长代谢影响的强弱主要受Carmichaeline、Karakolidine、Isotalatizidine、Neoline、 Fuziline、dehydrated benzoylhypaonitine、14-benzoylhypaconine Benzoyldeoxyaconine、Benzoyl Mesaconitine、Benzoyl Aconitine、Hypaconitine、 14-benzoyl-10-OH-aconine、Foreaconitine、Mesaconitine共14个成分的影响,即毛莨科乌头属药材“热性”差异的物质基础。6基于网络药理学的附子类药材“热性”的表征机制研究采用网络药理学方法,将“谱-效”关系研究筛选的26个目标成分(成分4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、16、17、20、22、23、24、25、26、27、28、29、30、32、33、34、35)导入TCM-PTD数据库,链接生物学信息数据库筛选相关作用靶点36个；利用DAVID分析软件对目标靶点群进行GO分析,最终确认与物质代谢和能量代谢相关的7条通路与附子类药材“热性”最为相关,主要包括脂肪酸代谢、多糖生物合成、多糖代谢、脂肪酸代谢、膜脂代谢、磷脂代谢和糖脂代谢通路。提示附子类药材“热性”的客观真实性主要与体内能量代谢多个环节相关。本研究通过考察不同产地附子、附子不同炮制品和毛莨科乌头属药材对线粒体代谢产热的影响,总结比较了其“热性”的共同作用规律和差异。通过文献回顾研究,确立了37个与附子类药材生物效应相关的化学成分,并作为评价成分含量差异的指标,采用UPLC-MS方法对附子类药材的化学成分进行指认。结果提示附子类药材对线粒体能量代谢影响的差异可能是由有效成分群和成分含量差异引起。采用网络药理学方法探索了附子类药材“热性”的生物学内涵,确认了与物质代谢和能量代谢相关的7条通路与附子类药材“热性”最为相关,这与前文的生物热动力学研究结果具有较高的相似度,提示附子类药材“热性”与能连代谢的关联机制与体内能量代谢多个环节相关。