研究背景和目的:原发性肝癌（hepatic cell carcinoma,HCC,以下简称肝癌）是世界上常见的恶性肿瘤之一,肝癌死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第二位。包括肝癌在内的多数恶性实体肿瘤的生长和转移依赖于血管生成,血管生成可为肿瘤细胞的增殖提供营养和代谢的通路,促进肿瘤的生长和转移,加快病情的恶化,故肿瘤血管生成现已成为热门的研究领域。贝伐单抗（Bevacizumab,Avastin,rhuMAb-VEGF）是人工合成的一种针对血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor,VEGF）的重组人源化IgG1型单克隆抗体。Bevacizumab特异性结合于VEGF后能阻碍后者与内皮细胞表面受体Flt-1及KDR结合,阻断VEGF介导的下游信号通路,使VEGF不能发挥促进血管内皮细胞增殖以及肿瘤内血管新生的作用,从而阻断对肿瘤生长至关重要的血液、氧气和其他生长必需的营养供应,使肿瘤无法在体内生长和散播转移,令化疗能够发挥有效的抗肿瘤作用,进而延缓肿瘤的生长和转移。Bevacizumab与放、化疗联合具有协同作用:①可使肿瘤区血管生成正常化,组织间高压减轻,利于化疗药物向肿瘤区输送。②放、化疗所致局部肿瘤区缺氧可促VEGF表达,帮助肿瘤细胞抵抗放、化疗的凋亡诱导机制;而联用Bevacizumab将预防此继发保护效应,使治疗反应增敏。临床观察到联合VEGF单抗和化疗所建立的生物化疗模式取得的有效率不仅远高于单用化疗或VEGF单抗,而且超过二者代数和,特别是对一部份复发/转移病人,已经无效的化疗药物在使用Bevacizumab等分子靶向药物后重新恢复敏感性。似乎Bevacizumab的抗肿瘤作用除了抑制肿瘤血管形成以外,还包括增加肿瘤细胞对化疗药物的敏感性。国内外目前均无对这种现象的合理解释。本课题研究的主要目的是探讨靶向药物与化疗药物单独及联合应用对肝癌的抑制作用,靶向药物与化疗的协同作用,为肝癌的综合治疗、提高疗效提供实验资料。第一章贝伐单抗对肝癌细胞增殖的抑制作用一、方法1、采用RT-PCR、免疫细胞化学的方法分析肝癌细胞株中VEGF、Flt-1、KDR基因和蛋白水平的表达:选用肝癌细胞株HepG2、SMMC-7721为实验细胞并选择人脐静脉内皮细胞系ECV-304作为VEGF受体表达的阳性对照,采用独立样本t检验从中筛选VEGF mRNA表达量高,Flt-1、KDR阳性表达且mRNA表达量高的肝癌细胞株,用于本课题的研究;2、MTT法检测Bevacizumab对肝癌细胞的增殖抑制作用:无血清条件下,0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml Bevacizumab作用于HepG2细胞48h,采用单因素方差分析（LSD法）比较不同浓度间及与对照组的增殖情况;3、Annexin V-FITC/PI双染检测细胞凋亡:无血清条件下,10μg/mlBevacizumab作用于HepG2细胞48h后,经Annexin V-FITC/PI双染,流式细胞仪检测凋亡情况。采用独立样本t检验分析比较Bevacizumab组和对照组;4、RT-PCR分析肝癌细胞株VEGF、Flt-1、KDR mRNA表达量的变化:无血清条件下,10μg/ml Bevacizumab作用于HepG2细胞48h后,行RT-PCR检测。采用独立样本t检验分析。二、结果1、RT-PCR结果示:肝癌细胞株HepG2中均有VEGF、Flt-1、KDR mRNA的表达,而SMMC-7721中只有VEGF、Flt-1 mRNA的表达;且HepG2中VEGF、Flt-1 mRNA的表达量均高于SMMC-7721（VEGF mRNA:P=0.001,t=9.056;Flt-1mRNA:P=0.000,F=55.975）;免疫细胞化学结果示:HepG2见VEGF、Flt-1及KDR的表达,SMMC-7721见VEGF、Flt-1的表达,无KDR的表达。因此,我们选用VEGF、Flt-1和KDR均表达的HepG2细胞作为实验用细胞;2、不同浓度Bevacizumab对肝癌细胞株HepG2的增殖有抑制作用。0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组细胞增殖抑制率分别为8.8%、27%、32%、26%。其中1μg/ml、10μg/ml、20μg/ml组与对照组比较差异均有统计学意义（P值分别为0.001,0.000,0.001）,但此三组间差异无统计学意义（P＞0.05）;3、Bevacizumab可诱导肝癌细胞株HepG2的凋亡。Bevacizumab作用于HepG2肝癌细胞48h后,10μg/ml Bevacizumab组的细胞凋亡率为（17.04±0.14）%,明显高于对照组（2.85±0.08）%（t=198.533,P=0.000）;4、Bevacizumab作用于肝癌细胞株HepG2后,其VEGF、KDR mRNA表达量均减少,与空白对照组比较差异具有统计学意义（t值分别为:12.476和5.071,P值分别为:0.000和0.007）;而Flt-1 mRNA表达量与空白对照组比较无显著差异（t=2.449,P=0.07）。三、结论1、人肝癌细胞株中存在VEGF及其受体的共同表达;2、Bevacizumab作用于肝癌细胞株HepG2后,其增殖受抑;细胞凋亡率增高;3、Bevacizumab对HepG2的增殖抑制作用可能是通过KDR介导的,同时随着肿瘤细胞的增殖抑制,其VEGF表达减少;4、Bevacizumab可能通过阻滞VEGF的自分泌作用而发挥对肝癌细胞的增殖抑制作用。第二章贝伐单抗联合吉西他滨对肝癌细胞增殖的抑制作用一、方法1、MTT法检测Bevacizumab联合吉西他滨对肝癌细胞的增殖抑制作用:实验分组为:10μg/ml Bevacizumab组,0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml吉西他滨组和Bevacizumab+不同浓度吉西他滨联合组,对照组加入无血清RPMI-1640培养基。培养72h后行MTT检测。采用析因设计资料的方差分析;2、Western Blot检测Bevacizumab联合吉西他滨对HepG2中ERK1/2、Bcl-2、Bcl-xl表达的影响:分别将Bevacizumab、吉西他滨、Bevacizumab联合吉西他滨及安慰剂作用于HepG2细胞,提取细胞蛋白后,行Western Blot检测。二、结果1、不同浓度吉西他滨对肝癌细胞株HepG2增殖的影响差异有显著性意义（F=1318.002,P=0.000）,吉西他滨单用与Bevacizumab联用对HepG2增殖的影响差异有显著性意义（F=1663.503,P=0.000）。且两者之间交互效应显著（F=41.832,P=0.000）。0.01μg/ml、0.1μg/ml、1μg/ml、10μg/ml吉西他滨组的抑制率分别为2.72%、15.31%、36.42%、74.87%,联合10μg/ml Bevacizumab后其抑制率分别为31.2%、50.48%、63.43%、83.66%;2、实验四组均在分子量为28 KD（Bcl-2、Bcl-xl）、44 KD和42 KD（ERK1/2）处出现特异性反应条带,其中空白组的Bcl-2及Bcl-xl的表达明显强于其余三组的表达。而Bcl-xl的表达在联合组最弱。空白组和单药Bevacizumab组的ERK表达与联合用药组及单药吉西他滨组比较明显减弱。三、结论1、Bevacizumab联合吉西他滨可增强吉西他滨单药对肝癌细胞的增殖抑制作用;2、应用了化疗药物后,ERK基因的表达被明显抑制,进而促进细胞凋亡。无论化疗药物还是分子靶向药物,均可以下调Bcl-2及Bcl-xl的表达,而当两药联合时,Bcl-2及Bcl-xl的表达下降更为明显。提示两者协同显著增强对靶向药物及化疗敏感性的机制可能与促进细胞凋亡及调控Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。第三章贝伐单抗联合吉西他滨对肝癌裸鼠皮下移植瘤治疗作用的研究一、方法1、Bevacizumab联合吉西他滨对肝癌移植瘤体积和MVD的影响:建立人肝癌细胞HepG2裸鼠移植瘤模型,每隔3天观察一次,用游标卡尺测量肿瘤的大小。实验分A组:空白对照组,予以无菌生理盐水,0.2ml/只;B组:Bevacizumab组,5mg/kg:C组:吉西他滨组,100mg/kg:D组:Bevacizumab 5mg/kg+吉西他滨100mg/kg联合组。各组给药均为2次/周,共4周,腹腔注射。自接种后第19天起,每周检测肿瘤体积。连续给药4周后停药一周,处死裸鼠,取移植瘤组织进行CD34染色检测各组微血管密度（MVD）。对照组与各治疗组间移植瘤体积比较采用重复测量数据的方差分析;对照组与各治疗组间MVD的比较采用单因素方差分析;2、Bevacizumab联合吉西他滨对荷瘤裸鼠皮下移植瘤VEGF、Flt-1、KDR、ERK、Bcl-2、Bcl-xl的影响:分别将Bevacizumab、吉西他滨、Bevacizumab联合吉西他滨及安慰剂作用于荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤,各组留取新鲜活组织标本10%中性多聚甲醛固定,常规脱水,石蜡包埋,4μm厚连续切片,进行苏木素-伊红（HE）染色后制备成免疫组化切片,采用标准EnVision^TM法进行免疫组化流程染色;3、Western Blot检测Bevacizumab联合吉西他滨对荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤中ERK1/2、Bcl-2、Bcl-xl表达的影响:分别将Bevacizumab、吉西他滨、Bevacizumab联合吉西他滨及安慰剂作用于荷人肝癌HepG2裸鼠皮下移植瘤,提取组织蛋白后,行Western Blot检测。二、结果1、各治疗组给药后体积与对照组相比增长均较缓慢,其中Bevacizumab联合吉西他滨组最为明显。Bevacizumab联合吉西他滨组与Bevacizumab、吉西他滨组之间均有显著差异（P值分别为0.004,0.010）,其抑瘤率分别为40.35%、45.61%、84.21%;2、与对照组比较,单药吉西他滨组MVD无显著差异（P=0.267）;单药Bevacizumab组及联合吉西他滨组的MVD均减少,与对照组比较差异均有统计学意义（P值均为0.000）;Bevacizumab联合吉西他滨组的MVD减少较Bevacizumab组更为显著,差异有统计学意义（P=0.000）;3、Flt-1在四组中均有较高的表达,其中在空白对照组和联合用药组中的表达均为强阳性;单药吉西他滨组和单药Bevacizumab组中Flt-1的表达均为中度阳性;各组间的差异并不明显。KDR在空白对照组中的表达为强阳性;单药吉西他滨组中KDR的表达为弱阳性;联合用药组和单药Bevacizumab组中KDR为阴性;4、实验四组均在分子量为28 KD（Bcl-2、Bcl-xl）、44 KD和42 KD（ERK1/2）处出现特异性反应条带,其中空白组的Bcl-2及Bcl-xl的表达明显强于其余三组的表达。而Bcl-2及Bcl-xl的表达均在联合组最弱。空白组和单药Bevacizumab组的ERK表达与联合用药组及单药吉西他滨组比较明显减弱。三、结论1、Bevacizumab与吉西他滨均可延缓肿瘤的生长,且Bevacizumab联合吉西他滨可显著增加二者单药的疗效;2、Bevacizumab可抑制移植瘤新生血管的形成,联合吉西他滨治疗后的移植瘤组织中新生血管形成减少更为显著;3、Bevacizumab极有可能直接封闭VEGF,阻断VEGF经由VEGFR-2进行的信号转导,阻止肿瘤细胞中新生血管的生成;4、应用化疗药物后,ERK基因的表达被明显抑制,进而促进细胞凋亡。无论化疗药物还是分子靶向药物,均可以下调Bcl-2及Bcl-xl的表达,而当两药联合时,Bcl-2及Bcl-xl的表达下降更为明显。提示两者协同显著增强对靶向药物及化疗敏感性的机制可能与促进细胞凋亡及调控Bcl-2及Bcl-xl的表达有关。