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该项研究拟利用"Dolly"的克隆技术路线,即是采取体细胞的电融合技术,以昆明小鼠为主要的实验材料,进行小鼠体细胞克隆(核移植)的初步研究,以摸索一些哺乳动物体细胞克隆的共同经验,为人类的治疗性克隆作一些铺垫性的基础实验的高技术探索性研究.研究方法1.为寻求一种体外稳定培养早期胚胎的方法.比较了M16(用作转基因动物的胚胎培养的培养基)、G1(人的8细胞胚胎的培养基)、CZB(一种囊胚培养基)从受精卵到囊胚的培养效果,并对CZB做了加糖与不加糖、加BSA(牛血清白蛋白)与15％FBS(胎牛血清)的比较研究.此外对体外形成的囊胚做细胞记数以评估胚胎的质量.2.寻找用电激活方法作小鼠体细胞克隆的适宜卵龄的卵母细胞及电激活参数.探讨SrC1<,2>(氯化锶)激活的可行性.在0.6kv/cm、80μs、2p电脉冲下,比较HCG后13、16、19、22h卵母细胞的激活率、碎裂+死亡率.在上述相同电脉冲下,比较经体外培养(IVC)和新鲜的卵龄为16、19、22h的卵母细胞的激活率,碎裂+死亡率.比较场强分别为0.6、0.9、1.2、1.5、1.8kv/cm,电压时程分别为10、20、40、80、100、150、200μs,两个脉冲对HCG后16h卵母细胞的电激活效果.研究SrCl<,2>在5、10、15、20 mmol/l的高浓度下,作用3、6、9h的激活及在1、1.5、2.0、3.0mmol/l低浓度下作用10min、6h的激活效果.3.为探讨2-c期受精卵电融合的适宜的参数,交流电场及电融合液对融合效果的影响.取正常2-c期的受精卵,观察在融合液中作用后清洗8次、不清洗的发育情况.融合脉冲前后给予20s的直流脉冲80v/cm 2MHz、600v/cm 2MHz,观察其对融合效果的影响.观察不同电压强度与电压时程配合下的融合效果.4.比较了表面张力法STA(Surface Tension Assisted)、A(透明带切口+粗去核管去核)、B(细去核管一步法去核)三种方法的去核效果.分别以0.6kv/cm、100μs、2p,1.2kv/cm、100μs、2p,1.8kv/cm、10μs、2p融合脉冲对体细胞与去核卵母细胞进行融合处理.在10~15℃和25~30℃两个温度范围下观察其对融合的影响.用成年小鼠成纤维细胞和胎鼠成纤维细胞做供体细胞进行核移植研究.