肿瘤是危害人类健康的最重要问题之一,通过对肿瘤标志物的检测,可实现早诊断、早治疗,能有效地控制肿瘤,最终实现患者的早日康复。肿瘤标志物在细胞或组织中的含量明显不同于正常值,肿瘤标志物的灵敏检测对肿瘤的早期诊断、治疗、扩散性、复发性等都具有重要的参考意义。近年来,microRNA与肿瘤的关系已成为生命科学的研究热点,其与多种恶性肿瘤,如淋巴癌、乳腺癌等之间的关系被相继报道,也被证明与许多疾病,如糖尿病,等其他一些组织病变有密切的关联,因此准确并灵敏的检测出microRNA的表达量对于研究其作用机制、疾病的治疗、相关基因药物的开发和某些癌症的早期预防和诊断具有十分重要的意义。最近科学家研究发现,6-甲基腺嘌呤(m6A)是促进microRNA生成的关键性转录后修饰。m6A也是真核生物mRNA上最常见的一种转录后修饰,这种可逆的RNA甲基化修饰与人类肿瘤、肥胖症等疾病有关。因此,microRNA和m6A的高灵敏检测具有重要的生物学和医学意义。本文主要研究了基于DNA构建的新型生物传感器,将适配体、DNA酶、生物纳米孔等技术结合使用,应用到肿瘤标志物microRNA、甲基化RNA以及肿瘤细胞的分析检测中,取得了良好的效果。(1)基于DNA杂交链式反应结合SYBR Green I荧光检测人胃癌血清中microRNA-21的研究本研究基于DNA杂交链式(HCR)反应,结合特异性荧光染料SYBR Green I,构建了一种荧光检测手段,实现了对人胃癌血清中microRNA-21的灵敏检测。以microRNA-21的碱基序列为基础设计出发夹型探针DNA H1和DNA H2,以靶标microRNA-21为启动子,发夹型探针DNA H1和DNA H2通过碱基互补规则形成双链DNA。随后,荧光染料SYBR Green I嵌入到双链DNA结构的小沟区域,以此产生较强的绿色荧光信号,完成对microRNA-21的灵敏检测。研究发现,在该检测体系的最优条件下,microRNA-21浓度的对数值在1-10~5 f M范围内与荧光信号成正比关系,检测限为0.2554 fM。该检测方法还实现了对胃癌患者血清与正常人血清microRNA-21的定量分析,结果表明胃癌患者血清中microRNA-21的表达水平较正常血清会表达上调。该研究实现了对microRNA的灵敏检测,为胃癌的诊断提供了新的途径。(2)基于发夹型DNA构建的电化学生物传感器灵敏检测甲基化RNA本探究以辣根过氧化物酶标记的IgG抗体结合在金纳米颗粒表面(HRP-IgG-AuNPs)作为电化学信号启动子构建的新型生物免疫传感器,实现了对甲基化RNA的高灵敏检测。本研究以含有m6A的RNA为检测对象。首先,纳米金修饰的金电极连接5’端巯基修饰的发夹型探针DNA,然后在辅助DNA存在的条件下,含有m6A的RNA与探针DNA互补配对结合。在T4连接酶的作用下,电极表面连接的发夹型结构转变为刚性DNA双链结构,甲基化抗体(Anti-m6A antibody)可以通过抗原-抗体的结合方式连接在该电极表面,经过三明治式的电极组装,HRP-IgG-AuNPs被引入到免疫传感器中,将组装完成的电极放入含有过氧化氢的溶液中进行氢醌的氧化,氧化反应产生的苯醌通过差分脉冲伏安法(DPV)进行检测。为了说明发夹型探针结构和HRP-IgG-AuNPs结构的优越性,本研究对直线型探针和发夹型探针、电化学信号启动子HRP-IgG-AuNPs和HRP-IgG分别进行了比较。甲基化RNA浓度在10-10~7 f M范围内呈现良好的线性关系,在信噪比为3的条件下,计算出的检测限为3.35 f M。实验结果表明,该传感器具有较高的灵敏性和良好的重现性。(3)基于生物蛋白纳米孔结合限制性核酸内切酶放大技术实现肿瘤细胞的灵敏检测本研究利用aerolysin纳米孔道对肿瘤细胞实现超灵敏检测。该研究以人B淋巴瘤细胞(Ramos cell)为检测靶标,结合DNA聚合酶和限制性核酸内切酶协同作用实现信号放大。首先,结合磁珠的Ramos cell适配体与其互补链(c DNA)杂交结合,当该杂交双链与Ramos cell结合后,cDNA被释放,通过磁性分离,得到包含c DNA的体系。结合磁珠的模板DNA与cDNA互补结合后,在DNA聚合酶和限制性核酸内切酶的协同作用下进行循环扩增产生output DNA,再次磁性分离得到包含output DNA的体系,通过aerolysin纳米孔道来定量分析output DNA,最终实现对Ramos cell的检测。利用该方法可实现5个Ramos cell的检测,并且该研究方法体现出很好的特异性,具有潜在的临床应用能力。