血栓栓塞性疾病是当前危害人类健康导致死亡的主要原因之一。防栓和溶栓是防治该病的关键。目前，国产正式应用于临床的溶栓药暂限于人尿激酶(Urokinase,UK)，链激酶(Streptokinase,SK)，而尿激酶和链激酶的溶栓效率有限且因无纤维蛋白溶解特异性，易发生治疗性出血。组织型纤溶酶原激活剂(tissue plasminogen activator,t-PA)是人血液中天然纤溶系统激活剂，与尿激酶和链激酶相比，人t-PA与血栓基质有很高的特异性亲和力。它能在血栓局部激活纤维蛋白原使其转化成具有生物活性的纤维蛋白酶，后者可水解血栓的基质——纤维蛋白，使凝血块溶解，血管再通，并且不引起血纤溶系统性激活，因而大大降低了治疗过程中出血的危险，是一种用于治疗急性心肌梗塞等血栓性疾病的特效药物。t-PA除了参与体内溶血和凝血的平衡调控外，还与其它一些重要的生理与病理过程密切相关，如组织再造、细胞迁移、排卵、补体激活、激肽产生，肿瘤侵袭等。 正常人体组织内，t-PA分布广，但含量非常低，如在血液中只有4-20μg/L。在人体内半衰期短，仅4～5分钟。因此从天然材料中很难大量制备t-PA，用于治疗甚至研究。通过基因工程手段获取大量t-PA是一条很有希望的途径。生产重组蛋白的方法各有优缺点。大肠杆菌缺乏修饰酶类，真核生物蛋白翻译后无法进行磷酸化、酰胺化等加工修饰，不能正确折叠，缺乏分泌作用形成无活性包含体。借助逆转录病毒载体将目的基因导入细胞有潜在致癌性，并引起宿主病毒感染的可能。酵母提纯工艺复杂、成本高，产品纯度达不到要求。构建高效表达载体以期得到高表达细胞株，是生产重组蛋白的有效方法。pcDNA3真核表达载体是构建基因表达重组体的有效载体，可在哺乳动物细胞中稳定持续表达。SV40郑州大学2003届研究生论文组织型纤溶酶原激活剂(t一队)真核表达载体的构建启动子和CMv启动子都是强启动子，本实验将t一PAcDNA置于SV40和CMV启动子调控之下，构建了真核表达载体pcDNA3一t一PA，为下一步研究转基因动物生产t~PA奠定了基础。材料和方法:以含t一PAcDNA的质粒PETPFR为模板，设计上下游引物(引物两端分别带Hindm和Sall酶切位点)，PCR扩增t一PA，用限制性内切酶Hindm和sall双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收2.Ikbt一PA酶切片段。PcDNA3用限制性内切酶Hindln和刀101双酶切，琼脂糖凝胶电泳回收5.4kb酶切片段。Sall和乃01的粘性末端互补。爪DNA hgase体外连接2.Ikb和5.4kb片段，16℃，过夜。重组体转化感受态JM 109细菌。将转化菌涂于含Amp的培养平皿，37℃温箱培养过夜。随机挑选10个克隆，接种于含Amp的LB培养基，37℃培养过夜，小提质粒，酶切鉴定。限制性内切酶Hindm单酶切，得到7.skb片段，Hindm和Xbal双酶切得到 5.4kb和2.Ikb片段，初步鉴定为阳性重组体。序列测定插入片段正确。重组pcDAN3一t一PA真核表达载体与脂质转染胺试剂L币。fectamineTMZooo混合转染乳腺癌(McF一7)细胞，G418筛选阳性细胞，获得了MCF一7阳性细胞系。结果:1.阳性重组质粒Hindm单酶切，琼脂糖凝胶电泳显示为7.skb条带，Hindm和Xbal双酶切，琼脂糖凝胶电泳显示为5.4kb和2.Ikb条带。2.插入片段序列测定正确，真核表达载体PcDNA3一t一PA构建成功。3.脂质转染胺试剂LIPofectamin矛M2000介导转染McF一7细胞，G418筛选，获得了MCF一7阳性细胞系。结论:1.本实验将t一PAcDNA置于SV40和CMv强启动子调控之下，成功构建了真核表达载体peDNA3一t一PA，为下一步研究转基因动物生产t一PA奠定了基础。2.建立了表达组织纤溶酶原激活剂任PA)的MCF一7阳性细胞系。 本实验构建的组织型纤溶酶原激活剂(t一PA)真核表达载体为在哺乳动物细胞和转基因动物表达研究奠定了基础，成为生产高效溶栓药t一PA的有效方法。