论文部分内容阅读
研究背景:前列腺癌是全球男性最常见的恶性肿瘤,已成为危害人民健康的重要疾病。目前,尽管早期局限性前列腺癌在外科手术、靶向放疗及内分泌治疗等方面取得了长足的进步,但是较晚期前列腺癌治疗效果仍不佳,患者易发生远处转移或进展为去势抵抗性前列腺癌,致使5年总体生存率较差。因此,寻找新的前列腺癌生物标志物和治疗靶点具有十分重要的临床意义。Circular RNA（circ RNA）是一类有别于线性RNA的新型闭合环状RNA,主要定位于胞浆或外泌体中,不易被RNase N酶降解,稳定存在于生物体内。已有研究证实circ RNA在癌症发生发展过程中发挥重要作用,但其在前列腺癌恶性进展过程中的作用仍未明确。研究目的:在体内外水平探讨hsa＿circ＿0036926对前列腺癌细胞的生物学效应及其分子机制。研究方法:（1）数据库筛选、前列腺癌组织及细胞系验证前列腺癌中异常表达的circ RNA:首先根据数据库筛选并鉴定在前列腺癌进展中可能发挥重要作用的circ RNA,并在前列腺癌组织及对应的癌旁组织中验证,进而明确最终的研究目标circ RNA。（2）目标circ RNA即hsa＿circ＿0036926的成环鉴定及其在前列腺癌的亚细胞定位:首先检测hsa＿circ＿0036926在前列腺正常上皮细胞（RWPE-1）及癌细胞（PC-3、DU145、22RV1、VCa P及LNCa P）的表达水平,随后将其PCR产物行Sanger测序确认是否成环,RNase R及放线菌素实验证明hsa＿circ＿0036926是否具有稳定性,核质分离实验明确hsa＿circ＿0036926在前列腺癌中的亚细胞定位。（3）体外实验探讨hsa＿circ＿0036926对前列腺癌细胞的生物学效应:CCK8实验检测hsa＿circ＿0036926下调后对前列腺癌细胞增殖的影响;流式细胞技术检测hsa＿circ＿0036926下调后对前列腺癌细胞凋亡及细胞周期的影响;Transwell实验检测下调hsa＿circ＿0036926后对前列腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。（4）体内实验验证hsa＿circ＿0036926在前列腺癌的促癌作用:构建稳定沉默hsa＿circ＿0036926的慢病毒载体,转染并筛选稳定沉默hsa＿circ＿0036926的前列腺癌PC-3细胞,在裸鼠腋下偏后方的位置皮下注射稳定沉默hsa＿circ＿0036926的PC-3细胞,观察hsa＿circ＿0036926对体内瘤体生长能力的影响。（5）明确hsa＿circ＿0036926海绵吸附的miRNA:首先利用在线数据库Circular RNA interactome（https://circinteractome.nia.nih.gov/）及Starbase（http://starbase.sysu.edu.cn）预测hsa＿circ＿0036926可能作用的miRNA,双荧光素酶报告基因实验验证hsa＿circ＿0036926与miRNA是否直接相互作用。（6）研究hsa＿circ＿0036926促进前列腺癌发展的分子机制:在稳定沉默hsa＿circ＿0036926的前列腺癌PC-3及22RV1细胞中转染相应的miRNA抑制剂,随后检测各组细胞中miRNA变化,CCK8实验检测转染miRNA抑制剂后对稳定沉默hsa＿circ＿0036926的前列腺癌细胞增殖的影响;Transwell实验检测转染miRNA抑制剂后对稳定沉默hsa＿circ＿0036926前列腺癌细胞迁移及侵袭能力的影响。（7）明确miRNA调节的下游靶基因:首先提取稳定沉默hsa＿circ＿0036926及阴性对照组的前列腺癌PC-3细胞的RNA行高通量测序,比较两组细胞之间的差异基因;利用Starbase数据库预测miRNA可能作用的下游靶基因,随后二者取交集,即得到miRNA作用的下游靶基因,双荧光素酶报告基因实验验证miRNA与CXCL8靶基因之间的相互作用。研究结果:（1）hsa＿circ＿0036926在前列腺癌细胞及组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织及正常前列腺上皮细胞系RWPE-1,且其高表达与患者的Gleason评分呈正相关,即组织中hsa＿circ＿0036926的表达量越高,患者的Gleason评分也越高。（2）hsa＿circ＿0036926是由PRC1的第3、4、5、6及7处外显子环化而成,并在前列腺癌PC-3细胞株中扩增出hsa＿circ＿0036926的全长为826bp,Sanger测序亦成功发现hsa＿circ＿0036926的成环位点,RNase R及放线菌素实验证实hsa＿circ＿0036926具有高度稳定性。核质分离实验表明hsa＿circ＿0036926主要定位于细胞质。（3）体外实验表明沉默hsa＿circ＿0036926可抑制前列腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭能力,并诱导细胞周期阻滞及促进凋亡,体内实验表明沉默hsa＿circ＿0036926可抑制前列腺癌细胞的皮下成瘤能力。（4）hsa＿circ＿0036926可海绵吸附miR-144-3p调节前列腺癌细胞的增殖及侵袭能力。（5）hsa＿circ＿0036926通过竞争性结合miR-144-3p调节其靶基因CXCL8的表达。研究结论:（1）hsa＿circ＿0036926在前列腺癌细胞及组织中高表达,且其表达水平与前列腺癌进展相关。（2）沉默hsa＿circ＿0036926抑制前列腺细胞的增殖、迁移及侵袭,诱导癌细胞周期阻滞并促进其凋亡。（3）hsa＿circ＿0036926通过调控miR-144-3p/CXCL8信号轴促进前列腺癌的恶性进展。