论文部分内容阅读
microRNA（miRNA）是一种非常重要的非编码小RNA,它的长度一般为20～25个核苷酸（nt）,广泛存在于真核生物中,主要起基因转录后水平的负调控作用。成熟的miRNA是由约70～90个碱基、具发夹结构的单链RNA前体（pre-miRNA）经过Dicer酶加工而成,然后通过与靶基因完全互补结合或不完全互补结合,进而降解靶基因或抑制翻译来调控靶基因的表达。作为重要的调节分子,miRNA参与各种各样的调节途径,包括细胞的生长和分化、细胞增殖和凋亡、脂肪代谢和肿瘤发生等。最近的相关研究发现,生物体内还存在与miRNA长度不同的另一类非编码小RNA——piRNA（Piwi-interacting RNA）,它们的长度约为30nt,最初是在哺乳动物生殖细胞中发现。这种小RNA与Argonaute蛋白家族成员中的PIWI蛋白结合才能发挥它的调控作用,主要调控mRNA的稳定性、蛋白质的合成、染色质组织和基因组的结构。由于对piRNA的研究尚处于初级阶段,它的一些具体的功能和生源论尚在研究当中。目前,关于非编码小RNA的研究迅猛发展,miRNA数据库中已经收录了9539条成熟的miRNA分子,包括了从病毒、细菌、绿藻等低等生物到人、黑猩猩等高度生物。而piRNA数据库中只包括了人、小鼠、老鼠、果蝇、斑马鱼和鸭嘴兽,低等生物中还尚未发现piRNA。在环节动物中,只发现了一种动物（多毛纲的小头虫）的miRNA,没有发现piRNA。蚯蚓属于环节动物门的寡毛纲,雌雄同体,具有很强的再生能力,本课题选择赤子爱胜蚓（Eisenia fetida）作为研究对象。由于赤子爱胜蚓的基因组尚未测序,因此对其miRNA和piRNA的鉴别研究工作存在很大难度,相关报道也是寥寥无几。但是,蚯蚓是重要的再生模式生物之一,对其miRNA及其再生相关miRNA的研究仍然具有十分重要的意义。因此本研究通过构建一个赤子爱胜蚓小RNA的cDNA文库,克隆到部分赤子爱胜蚓miRNA和piRNA,为以后研究其在再生过程中的调控作用打下一定的基础。首先选取赤子爱胜蚓性成熟的（有生殖环）个体大量提取总RNA;接着经10%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳,纯化回收16～30nt的小RNA;然后在小RNA两端分别加上3′接头和5′接头,每加完一个接头需要用PAGE分离纯化;再做反转录PCR,PCR产物经纯化回收目的片段后进行BanⅠ酶切,用T4 DNA连接酶进行自连,之后于两端加A;最后,与T载体连接,用TSS法制备和转化感受态细胞,建立cDNA文库。利用蓝白斑对文库进行初次筛选,再用菌落PCR进行再次筛选排除假阳性,将含有目的片段的43个菌落送出测序,得到20条单一的序列;在Genbank中的EST数据库和冗余数据库、miRNA数据库和piRNA数据库中进行BLAST比对,对于初步确定为候选miRNA的序列,用Mfold 3.2或RNA Structue软件进行二级结构的预测分析,以及A+U含量的分析。最后确定获得8条候选的蚯蚓miRNA、7条候选的piRNA和5条其它非编码小RNA。选用qRT-PCR方法进行不同组织的表达量分析,选择5.8S rRNA作为内参基因,选择了1条候选miRNA和3条候选piRNA作为目的基因,采用2-ΔΔCt法计算不同组织的表达量。结果说明再生组织中的表达量都大于正常组织,且每个小RNA的表达量都不一样,P2810表达最高,而P281-1表达最低。