骨骼肌在人体内分布广泛，在法医检验鉴定工作中，我们经常遇见骨骼肌挫伤的案例。在骨骼肌挫伤之后，骨骼肌损伤愈合过程也会随之开始。骨骼肌损伤愈合过程包括：炎症、增殖和修复。在整个损伤愈合过程中有大量的炎症因子、细胞因子和化学介质等参与其中，这些因子的表达直接或间接的对骨骼肌损伤愈合起着重要的作用。目前法医学上针对骨骼肌损伤愈合过程中各种因子或介质的研究报道很少，所以我们的研究就从这方面出发，对于骨骼肌损伤愈合过程中相关因子的表达做一初步探讨。　　 Nrfs(nuclear factor-erythroid2 p45 subunit-related factors)属于CNC(capncollar)家族成员，是具有高度保守的碱性亮氨酸拉链(bZIP)结构的转录因子。Nrfs有Nrf1、Nrf2和Nrf3三个亚型。其中Nrf1与Nrf2广泛的存在于各种组织和多种细胞型中。　　 在氧化应激情况下，Nrf1和Nrf2都可以进入细胞核内和抗氧化反应元件(ARE)结合，调节多种抗氧化基因的表达，从而对于机体的氧化损伤具有重要的保护作用。另外近年来的实验研究显示Nrf1对于哺乳动物的生长发育、肝脏保护以及骨骼发育都起着重要的作用。敲除Nrfl的小鼠胚胎会因为肝脏造血异常导致贫血死亡。Nrf2对于呼吸系统疾病、肿瘤的发生具有保护作用，同时还有肝脏保护、神经保护、细胞保护等功能。但是，Nrf1和Nrf2是否参与骨骼肌挫伤愈合过程的调节，目前国内外还尚未见研究报道。　　 本课题成功的建立了大鼠骨骼肌挫伤动物模型，并联合应用了免疫组化、荧光双染、real-time PCR及Western blot等技术对标本进行检测，旨在探讨：(1)Nrf1和Nrf2的表达分别随时间规律性的变化，是否有可能应用于法医学中骨骼肌损伤时间的鉴定；(2)骨骼肌挫伤过程中Nrf1和Nrf2表达在多种细胞类型的具体位置以及表达时间等，来深层探讨两因子在骨骼肌挫伤愈合过程中的作用，探索骨骼肌挫伤愈合过程的新机制，为进一步阐明骨骼肌挫伤愈合的分子机制奠定基础，为今后法医学中研究骨骼肌损伤愈合提供新的途径和方法，并为法医学在骨骼肌损伤时间鉴定方面提供新的方法。　　 材料与方法　　 1、骨骼肌挫伤动物模型的建立　　 健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠45只，体重280～320g，随机分为9组。其中骨骼肌挫伤分为8个时间段组，另一组为正常对照组，每组均为5只大鼠。腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后，后肢剪毛备皮。将大鼠后肢置于伸膝、踝背屈90°位置，用自制打击器(重500克)打击大鼠右下肢距跟骨2.5cm处，打击处做好标记。伤后肌肉仍保持完整，胫腓骨无骨折，不给予任何处理。伤后每只单独饲养，给予饲料及自来水，保持垫料清洁及空气通畅。分别于伤后6h、12h、ld、3d、5d、7d、10d和14d向大鼠腹腔内注射过量戊巴比妥钠致死，取挫伤处骨骼肌组织，正常对照组大鼠麻醉后背部剪毛，不做挫创，观察至14d，注射过量戊巴比妥钠致死，取相同部位同等大小肌肉。各组5只大鼠的肌肉样本被均分为两部分，一部分用于石蜡切片进行HE染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色，另一部分用于Western blot和real-time PCR检测。　　 2、组织化学和免疫组织化学染色　　 所取肌肉样本经4％多聚甲醛(pH7.4)固定12h，脱水、透明，包埋在石蜡中，制作5μm厚度连续切片，进行HE染色及Nrf1、Nrf2的免疫组化染色。　　 3、免疫荧光染色　　 石蜡切片常规脱蜡至水，进行Nrf1/MPO、Nrf1/MAC387、Nrf1/α-SMA、Nrf2/MPO、Nrf2/MAC387、Nrf2/α-SMA之间的双重免疫荧光的共定位。　　 4、Western Blot检测Nrf1和GAPDH蛋白　　 提取样本总蛋白，上样量为50ug，转印到PVDF膜上后用5%脱脂奶粉封闭，用兔抗大鼠Nrf1多克隆抗体(1:300)、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体(1:1000)4℃孵育过夜，分别用相应的二抗孵育，ECL显影，胶片中的蛋白条带经Biolmaging systems采集后进行灰度值测定。目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度值的比值作为相对表达量。　　 5、实时定量多聚酶链反应(real-time PCR)检测Nrf1和GAPDH的mRNA　　 用Trizol Reagent提取肌肉样本的总RNA。紫外可见光分光光度计测定OD260/OD280值，并且计算RNA浓度，将样品部分RNA稀释成至0.5μg/μl，-80℃冰箱保存备用。按PrimeScriptTM RT reagents Kit说明，进行反转录反应。应用Applied Biosystems7500 Real-Time PCR System，采用标准程序两步法进行PCR扩增，并通过一个循环采集荧光信号，绘制融解曲线。　　 6、统计学分析　　 用SPSS13.0 for Windows进行数据分析，以P<0.05为差异，有统计学意义。　　 实验结果　　 一、挫伤后形态学改变　　 伤后6h，挫伤处骨骼肌可见多形核细胞(polymorphonuclear cells，PMNs)浸润。伤后12h，聚集在挫伤区PMNs和圆形的单个核细胞(mononuclear cells，MNCs)进一步增多。伤后1d，以MNCs为主。伤后3d，MNCs和纺锤形的成纤维样细胞(fibroblastic cells，FBCs)大量出现。伤后5d～7d，挫伤处骨骼肌基本被清除干净，并被新生的骨骼肌细胞取代，新生的多核肌管(multinucleatedmyotubes)数量逐渐增加，多存在于挫伤中心区。同时，PMNs数量减少，并可见新生血管和胶原纤维形成。伤后10d～14d，主要是FBCs，偶见MNCs，纤维化程度进一步加重。挫伤区新生多核肌管多已与损伤周边区存在的肌纤维残端融合，孤立存在的多核肌管数量减少，可见新生血管形成。　　 二、免疫组织化学染色　　 1、在对照组和骨骼肌挫伤后各时间段中Nrf1的表达　　 对照组大鼠骨骼肌中，骨骼肌细胞浆和细胞核显示了Nrf1的弱阳性反应。骨骼肌挫伤后6h～12h，大部分PMNs和少量MNCs的胞浆和胞核中呈Nrf1阳性表达。伤后1d～3d，Nrf1主要表达于MNCs的胞浆和胞核。伤后5d～14d，Nrf1阳性反应主要见于FBCs的胞浆和胞核中。此外，伤后5d～14d，多核肌管和新生的毛细血管内皮细胞的胞浆和胞核也显示Nrf1阳性反应。　　 2、在对照组和骨骼肌挫伤后各时间段中Nrf2的表达　　 对照组大鼠骨骼肌细胞浆显示了Nrf2的弱阳性反应。骨骼肌挫伤后6h～12h，大部分PMNs和少量MNCs的胞浆中呈Nrf2阳性表达。伤后1d～3d，Nrf2主要表达于MNCs的胞浆中。伤后5d～14d，Nrf2阳性反应主要见于FBCs的胞浆中。此外，伤后5d～14d，多核肌管和新生的毛细血管内皮细胞的胞浆也显示Nrf2阳性反应。　　 三、双重免疫荧光鉴定表达Nrf1和Nrf2的细胞型　　 在大鼠骨骼肌挫伤愈合的过程中，Nrf1和Nrf2时序性表达于中性粒细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞。　　 四、Western blot和real-time PCR检测　　 观察大鼠正常骨骼肌和各挫伤组Nrf1蛋白和mRNA的相对表达。骨骼肌挫伤后各时间段Nrf1蛋白和mRNA变化规律基本一致。和正常组比较，伤后6h Nrf1蛋白和mRNA水平开始增高，伤后1d达到高峰，随后逐渐降低。　　 结论　　 1、在正常大鼠骨骼肌中，肌细胞核和细胞浆中弱表达Nrf1，肌细胞浆中弱表达Nrf2。　　 2、大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中，Nrf1时序性表达在中性粒细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞、再生多核肌管和新生毛细血管的内皮细胞的胞浆和胞核中，提示Nrf1可能参与骨骼肌挫伤愈合。　　 3、大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中，Nrf1表达的规律性变化可用于骨骼肌挫伤时间的推断。　　 4、大鼠骨骼肌挫伤愈合过程中，Nrf2表达在中性粒细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞、再生多核肌管的胞浆中，未在细胞核中表达，提示Nrf2可能不参与骨骼肌挫伤愈合。