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林可霉素是林可链霉菌(Steptomyces lincolnensis)产生的一种林可酰胺类抗生素,主要用于治疗革兰氏阳性菌引起的感染性疾病。林可霉素由4-丙基脯氨酸(PPL)和α-甲硫基林可酰胺(MTL)通过缩合反应生成去甲基林可霉,进一步甲基化而生成。林可霉素生物合成涉及30个基因,然而大部分基因的功能主要局限在序列比对和生物信息学分析,通过实验研究确定基因功能对于林可链霉菌基因改造和提高林可霉素发酵产量具有十分重要的意义。本文首次建立并优化了大肠杆菌-林可链霉菌菌丝体接合转移方法,其中最佳条件为,在含有10.3%蔗糖SM液体培养基中培养3d,菌丝与大肠杆菌在含有20mM MgCl2的MS固体培养基进行接合转移。该方法简便、高效,适合于林可链霉菌等孢子形成较少或不适做孢子接合转移链霉菌的遗传转化。本文构建了lmbU、lmbD、lmbV、lmbW的敲除菌株,研究了对林可霉素生物合成基因簇转录和效价的影响。结果表明lmbU、lmbD、lmbV是林可霉素生物合成的全局正调控基因,影响PPL合成基因、MTL合成基因、抗性基因、其它基因的转录水平。敲除lmbW,只能合成林可霉素B而无A组分,首次实验确证了lmbW基因的功能是负责PPL合成支路中,对乙烯基支链进行甲基化生成丙基支链。本文构建了lmrABC、lmbGHIJ、lmbW、lmbUYX基因过表达菌株,表明增加这些基因的拷贝数对提高林可霉素的产量具有很重要的意义。过表达S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因metK和透明颤菌血红蛋白vgb基因也能促进菌体生物量和提高林可霉素发酵效价。本文建立了大肠杆菌-林可链霉菌菌丝体结合转移方法,明确了林可霉素生物合成基因簇中的3个调控基因及其调控的靶基因,并通过过表达和外源基因表达对林可霉素生物合成进行了初步的改造研究,为以后深入研究林可霉素生物合成机理与途径工程,提高林可链霉菌发酵产量和质量奠定了基础。