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背景与目的:梅毒螺旋体(Treponema pallidum,Tp)是性传播疾病梅毒的病原体,可导致多器官系统受累,严重危害人体健康。梅毒与AIDs传播途径基本相同,可增加人体感染HIV风险。近年来,我国梅毒发病率呈上升趋势,在法定报告的传染病中,其发病数已超过淋病而居性传播疾病首位。因此,如何有效预防和控制梅毒已成为一个重要的公共卫生问题。防控梅毒的首要任务是研制有效疫苗,而Tp致病机制尚不清楚阻碍了梅毒疫苗的研制。目前认为,梅毒患者感染Tp后出现的硬下疳等组织病理损伤主要由局部炎症反应所致,但引起炎症反应的致病物质仍不清楚。细菌鞭毛蛋白是细菌鞭毛的主要结构蛋白,其不仅可诱导宿主发生炎症反应,还可作为疫苗载体蛋白或疫苗佐剂,增强相关抗原的免疫保护作用。本研究以人单核细胞为模式细胞,明确Tp鞭毛核心蛋白能否诱导炎症反应,阐明其与受体相互作用的分子机制及相关信号通路,随后在筛选有效Tp候选疫苗的基础上,进一步确定其是否具有免疫佐剂潜力。本研究将为阐明Tp致病机制及设计梅毒疫苗提供新思路,对梅毒的预防及控制具有重要科学意义。方法:1.三个Tp鞭毛核心蛋白刺激THP-1细胞24 h后,q RT-PCR检测IL-6、IL-8、IL-10、IL-1β和TNF-α的m RNA转录情况,Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激THP-1细胞后检测IL-6和IL-8的最佳表达时间和最佳表达浓度;THP-1细胞转染My D88负显性突变体质粒或TLR4、TLR5干扰质粒后以Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激细胞,q RT-PCR和ELISA分别检测IL-6和IL-8的m RNA转录水平和蛋白表达水平。2.Fla B1、Fla B2或Fla B3刺激THP-1细胞后,Western Blot检测ERK1/2、p38、JNK和IκBα的磷酸化水平,免疫荧光检测p65的核转位;采用ERK1/2(PD98059)、p38(SB203580)、JNK(SP600125)和NF-κB(BAY117082)的特异性抑制剂预处理细胞后,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录水平。3.克隆表达并纯化27个缺失突变体肽段,各肽段刺激THP-1细胞后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,免疫共沉淀检测Tp鞭毛核心蛋白各肽段与TLR5的相互作用;THP-1细胞转染4.0μg psi RNA-h TLR5后,再分别以相应浓度肽段刺激细胞1 h,Western Blot检测ERK1/2、p38和IκBα的磷酸化水平,刺激细胞24 h后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况。4.克隆表达并纯化21个Tp鞭毛核心蛋白突变体,各突变鞭毛核心蛋白刺激THP-1细胞后,q RT-PCR检测IL-6和IL-8的m RNA转录情况,免疫共沉淀检测Tp鞭毛核心蛋白突变体与TLR5的结合。5.将新西兰兔随机分为Tp0663免疫组、Tp0136免疫组和佐剂对照组,每组3只,取纯化好的重组蛋白Tp0136和Tp0663与弗氏完全(或不完全)佐剂充分混合,每2 w免疫1次,共免疫3次,ELISA检测兔血清中特异性抗体滴度及INF-γ水平。6.末次免疫2 w后,用8×106 Tp Nichols菌株背部皮内攻击新西兰兔,感染后的0~3 w期间,每隔3 d观察皮损变化情况,感染21 d后,q RT-PCR检测新西兰兔皮损部位及血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量,免疫组化检测皮损和睾丸中的Tp载量,H&E染色观察皮损和睾丸的炎症情况。7.将C57BL/6小鼠随机分为Tp0663免疫组、Fla B3免疫组、Fla B3+Tp0663联合免疫组和PBS对照组,每组8只,取纯化好的重组蛋白每2 w免疫C57BL/6小鼠,共免疫3次。ELISA检测小鼠血清中Tp0663特异性抗体效价和小鼠脾细胞上清中的细胞因子,CCK8检测淋巴细胞的增殖,流式检测小鼠脾淋巴细胞的胞内细胞因子表达。8.末次免疫2 w后,用1×107 Tp Nichols菌株攻击C57BL/6小鼠,感染30 d后,q RT-PCR检测小鼠直肠、脑、淋巴结、血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量,免疫组化检测小鼠肝脏、脾脏和睾丸中的Tp载量;取各免疫组经Tp感染30 d后的淋巴结(每组3只),分别接种至新西兰兔睾丸中,每周抽取兔耳缘静脉血,利用RPR试剂盒和TPPA试剂盒检测血清反应性,9 w后,暗视野观察睾丸组织中的Tp活动性。结果:1.Fla B1、Fla B2和Fla B3刺激THP-1细胞后能诱导IL-6和IL-8表达升高,Fla B1、Fla B2和Fla B3的最佳刺激浓度分别为1.0、10.0和5.0μg/m L,三者诱导IL-6和IL-8的最佳m RNA转录时间均为24 h,最佳蛋白表达时间均为48 h。THP-1细胞转染My D88负显性突变体质粒和TLR5干扰质粒后能显著抑制IL-6和IL-8的表达,转染TLR2负显性突变体质粒和TLR4干扰质粒后不影响IL-6和IL-8的表达。2.Fla B1、Fla B2和Fla B3作用THP-1细胞后可诱导ERK1/2、p38和IκBα发生磷酸化,并诱导p65发生核转位。ERK1/2、p38和NF-κB特异性抑制剂预处理细胞后,Fla B1、Fla B2和Fla B3诱导的IL-6和IL-8表达受到不同程度的抑制。3.各缺失突变体蛋白刺激THP-1细胞后仅含D1结构域的蛋白可诱导IL-6和IL-8表达及ERK1/2、p38和IκBα发生磷酸化,仅含ND1区的肽段缺失突变体可与TLR5结合。THP-1细胞转染TLR5干扰质粒后能明显抑制Tp鞭毛核心蛋白D1区诱导的ERK1/2、p38和IκBα磷酸化和IL-6、IL-8 m RNA转录。4.所有位点突变均不同程度抑制了Tp鞭毛核心蛋白诱导的IL-6和IL-8转录,且不同程度地抑制了Tp鞭毛核心蛋白与TLR5的结合。5.重组蛋白Tp0663和Tp0136免疫新西兰兔后能产生较高水平的特异性抗体,且兔血清中的INF-γ含量也较对照组明显升高。6.Tp0663和Tp0136免疫组Tp感染部位的皮损直径显著小于PBS对照组,感染部位的皮损溃疡率也显著低于PBS对照组;Tp0663和Tp0136免疫组在原始感染部位及血液、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量均显著低于PBS对照组(P<0.05);Tp0136和Tp0663免疫组与PBS对照组的原始感染部位炎性细胞浸润明显,而远端睾丸组织中,仅PBS对照免疫组出现炎性细胞浸润。7.重组蛋白Fla B3与Tp0633联合免疫C57BL/6小鼠后,小鼠血清中Tp0663特异性抗体的含量、小鼠脾淋巴细胞中分泌IFN-γ的CD4+T细胞百分比、小鼠脾淋巴细胞上清中分泌的IFN-γ水平及小鼠脾淋巴细胞增殖分化能力均显著高于Tp0663免疫组和PBS对照组免疫组。8.Fla B3+Tp0663联合免疫组小鼠血液、脑、淋巴结、肝脏、脾脏和睾丸组织中的Tp载量均显著低于Tp0663免疫组和PBS对照组(P<0.05);Fla B3+Tp0663联合免疫组小鼠直肠中Tp载量与PBS对照组和Tp0663免疫组小鼠直肠中Tp载量相当。小鼠淋巴细胞悬液转至新西兰兔睾丸后,PBS对照组、Fla B3免疫组、Tp0663免疫组和Fla B3+Tp0663联合免疫组出现血清转化的时间分别为20、32、32和52 d,暗视野显微镜仅观察到PBS对照组兔睾丸中存在活Tp。结论:1.Tp鞭毛核心蛋白经TLR5/My D88依赖的MAPKs和NF-κB信号途径诱导THP-1细胞表达IL-6和IL-8。2.Tp鞭毛核心蛋白的D1区是激活TLR5的关键区域,其ND1区的R89、L93和E113三个氨基酸位点是与TLR5相互作用的关键位点。3.Tp外膜蛋白Tp0663和Tp0136免疫新西兰兔后可以延缓病损的发展并抑制Tp在新西兰兔体内的扩散。4.Tp鞭毛核心蛋白Fla B3可以增强Tp0663的免疫原性,具有免疫佐剂的潜力。其与Tp0663联合免疫C57BL/6小鼠后,可以抑制Tp在小鼠体内的扩散。