黄曲霉毒素对粮油质量安全的污染形势十分严峻。花生是我国主要的粮油作物之一,在种植、生长、乃至收获、储藏等各个环节中都易受黄曲霉毒素污染,严重地影响了我国花生质量安全,成为花生产业发展的制约因素。为了探寻绿色的花生黄曲霉毒素污染防控途径,本研究在湖北黄陂花生地里采集的花生荚果上筛选出了一株对黄曲霉菌有抑制生长及产毒作用的生防菌株,根据菌落形态观察及分子鉴定,确定其为肠杆菌科的非脱竣勒克菌Leclercia adecarboxylata 命名为wt16,本文将重点探析非脱羧勒克菌对花生黄曲霉菌及其毒素污染防控效果。1.分离鉴定获得了第一手我国花生产区产毒黄曲霉菌株。从我国花生产区江西樟树、湖北黄陂、福建郡武、广西柳柳口、福建泉州、广西北海、九江都昌、南昌进贤、湖北红安等地采集花生土壤样品,在PDA培养基上采用涂布平板法,分离纯化出9株菌株,结合形态学鉴定与ITS序列分析,确定该9株菌株均为黄曲霉菌株;采用免疫亲和柱-HPLC标准方法测定了这些菌株的产毒力,结果表明,73、501、54、pc400、pg11、pg12、271、393-2、pc157-2等9株黄曲霉菌株产毒力均在100ng/mL以上,为高产毒菌株。这些产毒菌株的获得为进一步开展我国花生黄曲霉及其毒素污染防控研究提供了第一手原始材料。2.从湖北黄陂花生地里采集花生荚果,在LB培养基上通过平板划线法筛选获得了一株细菌,通过观察它的个体形态特征、水解淀粉能力以及进行16SrDNA测序,确定其为非脱羧勒克菌Leclercia adecarboxylata,命名为wt16。本课题将使用非脱羧勒克菌wt16菌株作为黄曲霉毒素污染生物防控菌株,以进一步研究其对花生黄曲霉及其毒素污染防控效果。3.表征发现了非脱羧勒克菌wt16菌株具有良好的抑制黄曲霉生长及产毒的生防作用。随机选择7株产毒黄曲霉菌株pg11、73、271、pc157-2、pc400、54、393-2与wt16菌株共培养于沙氏液体培养基中,待5 d后将菌丝烘干称重,发现wt16菌株对黄曲霉菌丝干重抑制率为76.9%-92.28%;并采用免疫亲和柱-HPLC标准方法测定其产毒力,发现wt16菌株对黄曲霉菌产毒的抑制率达90.17%-95.55%,说明非脱羧勒克菌wt16对黄曲霉菌的生长及产毒均有很好的抑制效果。为了探究wt16菌株是否对黄曲霉菌丝形态造成影响,在扫描电子显微镜下观察了经wt16菌株处理过的及未经wt16菌株处理过的黄曲霉菌丝,结果发现,未经wt16菌株处理过的黄曲霉可形成规则的菌丝球体,单个菌丝呈细长型,表面有绒毛,而与wt16作用后,黄曲霉菌丝会聚集成不规则形状,单个菌丝会由细长型断裂成小截形态,菌丝表面会变得较光滑,说明wt16菌株能改变黄曲霉菌丝形态。4.探究了非脱羧勒克菌wt16抑制黄曲霉菌生长与产毒的机制。将wt16生防菌株分为上清液,经121 ℃、30 min高温处理过的上清液、死菌体三部分与黄曲霉菌作用,5 d后观察黄曲霉菌丝形态发现,上清液中的黄曲霉菌基本没有生长,而高温处理过的上清液及死菌体对黄曲霉菌的生长均没有影响;采用免疫亲和柱-HPLC标准方法测定其产毒力发现,上清液及高温处理过的上清液均能有效抑制黄曲霉菌的产毒,而死菌体则不能抑制黄曲霉菌产毒。从实验结果我们可以知道,wt16菌株能在液体培养基中分泌一些代谢产物,其中某些代谢产物可以抑制黄曲霉菌的生长与产毒,但抑制黄曲霉菌生长的代谢产物在高温条件下会失活,而能抑制黄曲霉菌产毒的代谢产物在高温处理后仍有抑制作用。5.建立了基于非脱羧勒克菌wt16的花生黄曲霉毒素污染防控技术。在营养条件复杂的花生粉上共培养wt16菌株及黄曲霉菌,观察花生粉被黄曲霉菌的侵染情况发现,在花生粉上,经由黄曲霉菌侵染的花生粉上长满了黄绿色的黄曲霉孢子,而wt16与黄曲霉菌共培养的花生粉上黄曲霉孢子明显减少,说明在花生粉上wt16菌株能有效抑制黄曲霉生长;用免疫亲和柱-HPLC法测定AFB1的含量,发现wt16菌株对黄曲霉菌的产毒也有明显的抑制作用,其抑制率达83.19%。在未受机械损伤的花生颗粒上共培养wt16菌株和黄曲霉菌,9 d后观察花生颗粒被黄曲霉菌的侵染情况发现,被黄曲霉菌侵染的花生粒表面长出许多黄绿色的孢子,而黄曲霉与wt16共培养的花生粒上黄曲霉孢子明显减少,采用免疫亲和柱-HPLC法测定AFB1的含量,通过计算发现wt16菌株对黄曲霉菌产毒的抑制率达88.64%,说明在未受机械损伤的花生颗粒上wt16菌株也能有效抑制黄曲霉的生长和产毒。本研究证明有抑制作用的成分主要存在wt16菌株发酵上清液中,在不同时间、温度、pH的条件下培养wt16菌株,制备上清液,加入黄曲霉孢子液培养5 d后用免疫亲和柱-HPLC法测定AFB1的含量发现,wt16菌株在pH 5-9,温度15-40 ℃,培养超过4 d的条件下制备的发酵上清液对黄曲霉菌产毒的抑制效果最好,而将最佳条件下制备出的wt16上清液,在花生粉上与黄曲霉菌共培养,发现其也对黄曲霉毒素的产生有明显抑制作用,抑制率达78.84%。本研究结果表明,非脱羧勒克菌Leclercia adecarboxylata wt16菌株为一株优良的生防细菌,其产生的抑菌活性物质为花生黄曲霉及其毒素污染生物防控提供了新的途径。