水稻是世界上最主要的粮食作物之一,尤其在亚洲,将近90%的人口以稻米为主食。然而在生产中,水稻产量和品质却受到许多生物胁迫的不良影响,尤其是虫害对其危害最为严重。水稻稻纵卷叶螟是一种具有迁徙特性的害虫,是水稻生产中最常见的虫害之一。在我国,自2003年以来,平均每年有2千万公顷稻田遭受稻纵卷叶螟危害,损失7.6亿公斤的稻谷。对于水稻稻纵卷叶螟的防治,目前人们最常用的方法是化学杀虫剂和Bt基因的应用,但是过量的使用化学杀虫剂不但对环境不利,同时也会导致昆虫对其产生耐药性。而长期使用Bt基因也已经使得某些害虫对其产生了耐受性,因此为了解决害虫的耐受性和提高植物的抗虫性,寻找新的抗虫基因已经成为当务之急。由于蝎昆虫神经毒素专门特异性地针对于昆虫神经系统起作用,而对哺乳动物毒害小或无毒害,因此其具有良好的抗虫应用前景。LqhIT2是从以色列黄蝎Leiurus quinquestriatus hebraeus (Ehrenberg)体内鉴定和分离出来的一种蝎昆虫长链抑制型神经毒素。成熟的LqhIT2多肽序列含有61个氨基酸,分子内形成4对二硫键,作用于昆虫的钠离子通道。已有研究证明LqhIT2蛋白能够有效地毒杀部分鳞翅目昆虫,但是关于LqhIT2基因转基因和其对稻纵卷叶螟的抗性研究还没有报道。本研究中,我们将LqhIT2基因导入籼稻品种粤泰B,系统地分析了其对水稻稻纵卷叶螟的抗性。LqhIT2转基因水稻的抗虫性分析显示：与野生型相比,LqhIT2转基因植株对稻纵卷叶螟的抗性明显提高,稻纵卷叶螟幼虫对转基因水稻的取食率明显下降。进一步对转基因水稻激素和代谢物分析显示：在LqhIT2转基因水稻植株体内,参与茉莉酸合成途径的原料亚麻酸、中间产物12-氧-植物二烯酸(12-OPDA),茉莉酸(JA)及其衍生物茉莉酸-异亮氨酸(JA-Ile)含量都明显增加,并且编码茉莉酸合成途径中关键酶脂氧合酶(LOX)基因的表达量也明显升高。与此同时,我们还发现在LqhIT2转基因水稻植株体内,编码苯丙烷代谢过程中关键酶苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)基因的表达量也明显上调,而苯丙烷代谢途径下游的与植物抗虫相关的两类次生代谢物木质素和黄酮类次生代谢物含量也得到了显著升高。同时,发现LqhIT2转基因植株中糖酵解途径的部分中间产物含量发生了变化。与野生型和空载体对照相比,LqhIT2转基因植株中淀粉、葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸的含量都明显减少,编码参与糖酵解过程的淀粉酶、己糖激酶和果糖激酶基因的转录本明显增加。次生代谢物和初级代谢物的变化趋势相符合。因此,我们推测除了LqhIT2多肽对稻纵卷叶螟产生毒性作用外,将LqhIT2基因导入水稻后还能够通过增加水稻亚麻酸含量和诱导编码脂氧合酶基因(LOX)的表达来激活水稻茉莉酸合成,增加茉莉酸含量,而茉莉酸又可通过诱导苯丙氨酸氨裂解酶(PAL)基因的表达来启动水稻苯丙烷代谢途径,从而诱导苯丙烷代谢途径下游与植物抗虫相关的两类次生代谢物木质素和黄酮类次生代谢物合成,提高水稻抗虫性。LMX是以LqhIT2为基础的人工优化神经毒素蛋白。相对于LqhIT2而言,LMX在非编码区有9个氨基酸的差异,二者氨基酸的一致性达85%,核苷酸的一致性达92%。在LMX毒性研究中,我们设置四个处理组(涂抹2.5μg、5.0μg7.51μg和LMX融合蛋白的叶片)和两个对照组(涂抹PBS buffer和10μgGST蛋白的叶片)饲喂稻纵卷叶螟3龄期幼虫。饲喂结果显示：幼虫对处理组叶片的取食情况均要好于对照组；处理组幼虫死亡率均高于对照组,并且取食LMX融合蛋白的幼虫致死率要高于取食LqhIT2融合蛋白的幼虫致死率；处理组幼虫平均体重增长和蜕皮过程均慢于对照组,并且处理组幼虫的α-蜕皮激素和β-蜕皮激素含量均低于对照组；在幼虫体内保护酶活性方面,除超氧化物歧化酶活性增加外,处理组中其余5种酶(α-乙酸萘酯酶、谷胱甘肽-S转移酶、过氧化氢酶、类胰蛋白酶和类胰凝乳蛋白酶)活性均下降。此外,转基因叶片喂虫结果表明：相比于对照组,幼虫对转基因水稻的叶片取食率减少了30%以上。人工接虫实验和大田自然感虫实验也显示：与野生型相比,LMX转基因水稻的分蘖损害率分别下降了14.7%-29.2%和30.6%-48.3%,叶片损害率分别下降了约19.3%-39.1%和19.1%-36.9%。因此优化蛋白LMX是一个提高植物抗虫性的有效候选新基因。