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抗体片段广泛应用原核表达系统进行表达。由于缺乏对外源蛋白表达时的过程机制的理解,通常需要通过“试错法”从多种参数的组合中筛选最优表达体系,但该过程费时费力且成功率低。研究者们对于根据蛋白质氨基酸序列预测其表达量的工作做了大量的努力,已发表的文章中成功构建了多个通过氨基酸序列预测蛋白表达量的模型,但模型均未得到广泛应用,原因在于数据来源不均一,影响模型的预测准确率。本研究通过高通量平行发酵及检测收集数据,确保数据的均一性。以抗体片段为研究对象,其分子量小、保守区氨基酸比例高,可变区变化丰富,是用于探索氨基酸序列变化对蛋白可溶性表达水平影响的理想分子模型。首先,本研究通过5 L发酵罐培养表达并纯化得到浓度为1.58 mg·m L-1的抗体片段溶液,作为后续检测表达量的标准品。通过在单域抗体的C端添加1个氨基酸,发现单个氨基酸的改变足以引起蛋白质可溶性表达量发生显著变化。其中G、P、C、Q既显著提高了胞外单域抗体的含量,亦提高了单域抗体在胞内的含量;而L的显著影响主要体现在胞外单域抗体含量的提高,W、F及Y的显著影响主要体现在胞内单域抗体含量的提高。通过层次聚类、Cluster Omega对随机挑选的65株CDR随机突变单域抗体分子的氨基酸序列与表达水平分别进行分类,发现两者分类一致的比例达到70%,证明了氨基酸序列与蛋白质表达水平间的关联。进一步通过线性建模分析这65个单域抗体分子的可溶性表达量,发现对单域抗体胞外含量有显著影响作用的氨基酸组合为S,R,N,D,Q,Y,F,G;对单域抗体胞内含量有显著影响作用的氨基酸组合为G,R,C,N,S,Y,K,A;对单域抗体蛋白总量有显著影响的组合为R,S,G,N,Y,C,Q,F,T。其中R、S和G的含量显著影响单域抗体的可溶性表达量且该影响不受分布位置的影响。蛋白质的极性亦是其可溶性表达水平的显著影响因素。本研究的结论可为抗体片段生产工艺的开发以及抗体药物的定向改造提供指导性理论依据。