背景:宫颈癌是全球第二大妇科肿瘤,发病率仅次于乳腺癌,且发病逐渐趋于年轻化。宫颈癌的病因较明确,同生活方式有密切关系,如早婚、早育、性生活过早或频繁、口服避孕药、抽烟、以及病原体感染等,其中,与宫颈癌发生关系最密切的是人乳头瘤病毒(HPV)的持续感染。早期宫颈癌可通过手术治疗,晚期和复发性宫颈癌主要采用放化疗,但效果并不理想。对于晚期和复发性宫颈癌,有待开发一种低毒、有效的治疗方式,而宫颈癌分子靶向治疗为解决这一问题提供了新思路。靶向治疗的关键在于发现与肿瘤细胞及组织具有较高结合特异性和敏感性的靶向分子或分子片段,进而展开靶向分子探针及靶向分子导向的靶向抗肿瘤药物载体的开发。目前,噬菌体肽库技术是筛选肿瘤靶向分子最为有效的方法。它是将外源肽和噬菌体衣壳蛋白融合而展示于噬菌体,再通过“亲和、消减、富集”的生物淘筛(Biopanning)流程筛选与靶分子特异性结合的噬菌体克隆。从肽库中筛出的多肽有特异性强、分子质量小、组织穿透力大、易合成、免疫原性低、毒副作用小等优点,有望将其与放射性核素、荧光标记物等偶联作为分子探针,用于肿瘤的早期影像诊断,而最重要的是,可通过偶联抗癌药物、纳米颗粒、化疗药物载体如脂质体等用于肿瘤的靶向治疗,可以在大大提高化疗药物疗效的同时,明显降低其毒副作用,因而具有十分广阔、诱人的社会经济前景。我们前期以SiHa细胞为靶细胞,以本实验室改良的Biopanning程序成功的筛选到了靶向宫颈癌细胞的阳性12肽噬菌体克隆,为本研究奠定了基础。目的:本研究就是在前期筛选的阳性噬菌体克隆的基础上,多层次、多角度的鉴定其结合特异性,并获得最佳的阳性噬菌体克隆,据其展示肽序合成多肽分子探针,从细胞/组织水平上对该多肽探针的结合特异性/敏感性进行了研究,为进一步利用其研发宫颈癌靶向分子探针早期诊断试剂、靶向化疗药物递送载体体系奠定基础。方法:1.本研究前期利用噬菌体展示技术,以人宫颈癌细胞SiHa为靶细胞,以人胚肾细胞HEK293为阴性吸附细胞进行Biopanning,获得了 6个与宫颈癌细胞结合特异较好的阳性噬菌体克隆;2.通过细胞免疫荧光、免疫化学法、流式细胞仪等方法进行鉴定噬菌体克隆与SiHa细胞的结合特异性,并确定最佳的阳性噬菌体克隆;3.采用宫颈癌临床组织鉴定最佳噬菌体克隆的组织结合特异性;4.根据最佳噬菌体克隆肽序合成未标记的探针多肽、对照多肽和FITC标记的探针多肽、对照多肽;5.通过竞争抑制实验、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测多肽探针与SiHa细胞的结合特异性/敏感性;6.采用宫颈癌临床组织、组织芯片鉴定多肽分子的组织结合特异性/敏感性;7.对多肽分子探针进行定位分析;8.以MTT法检测多肽分子探针的细胞毒性;9.通过生物信息学方法预测分析多肽分子的理化性质及二级结构;10.预测可能与多肽分子探针相互作用的靶分子,并用AutoDock4.2.6软件进行分子对接。结果:1.通过细胞免疫荧光、细胞免疫化学及流式细胞仪鉴定,与SiHa细胞结合特异性最佳阳性噬菌体克隆为S7;2.组织免疫荧光结果显示S7克隆与宫颈癌组织有较好的结合特异性;3.未标记的探针多肽、对照多肽和FITC标记的探针多肽、对照多肽分别被合成,命名为 CSP3 Probe、Ctrl Probe 及 FITC-CSP3 Probe、FITC-Ctrl Probe;4.利用合成的各种多肽做的竞争抑制实验、激光共聚焦扫描显微镜、流式细胞仪检测结果显示CSP3 Probe与SiHa细胞有较好的结合特异性/敏感性;5.通过宫颈癌临床组织和组织芯片鉴定,CSP3 Probe与宫颈癌组织结合特异性/敏感性良好;6.CSP3 Probe结合位点位于细胞膜上;7.MTT检测结果显示CSP3 Probe对SiHa细胞没有毒性作用;8.经生物信息学分析,多肽CSP3是一个疏水性较弱的分子,二级结构为无规则卷曲;9.利用ScanProsite搜索到了一个可能与CSP3相互作用的分子ADF-H,分子对接结果显示ADF-H可能是CSP3的靶分子。结论:通过多层次、多角度的鉴定,均表明CSP3 Probe与宫颈癌细胞/组织有良好的结合特异性/敏感性,CSP3 Probe可偶联放射性同位素、纳米颗粒、抗癌药物、化疗药物载体如脂质体等用于宫颈癌的早期影像诊断和靶向治疗。