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成年哺乳动物脑内存在着能够增殖、自我更新,并具有多向分化潜能的可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞的神经干细胞。这些生物学特点使神经干细胞能够应用于治疗中风等脑损伤疾病。正常情况下,神经干细胞处于静息状态,当脑部受到损伤刺激时,NSCs可被激活,增殖、迁移至损伤部位,分化成相应的神经细胞,参与形成神经环路,促进脑损伤结构和功能的修复。本研究拟探讨人参皂苷通过调节HIF-1α对中风后神经干细胞增殖与分化的作用,从分子水平上研究中药有效成分促进神经干细胞增殖与分化的作用机制,为应用中医药干预干细胞移植、促进新生神经元存活和治疗神经系统疾病的研究提供理论依据。1胎鼠海马神经干细胞的分离培养与鉴定从孕17天SD大鼠胚胎的大脑中分离海马神经干细胞并进行体外无血清培养,用10%的胎牛血清诱导分化,采用免疫荧光染色的方法对分离培养的细胞进行鉴定。结果可获得Nestin和Brdu阳性的具有增殖能力的神经干细胞,经血清诱导分化后可获得Tuj-1和Vimentin阳性的神经元和星形胶质细胞。提示采用无血清并添加特定生长因子的培养方法,可获得在体外稳定增殖并具有多向分化潜能的神经干细胞。2几种中药单体及有效成分对神经干细胞增殖分化的作用分离胎鼠的海马组织,采用无血清的细胞培养方法进行体外培养,将不同浓度的几种中药有效成分(人参皂苷、黄芪甲苷、人参皂苷Rg1、Rb2、Re、 Rf、麦冬皂苷D)加入到神经干细胞单细胞悬液中,培养3天,应用MTT法测定不同浓度的各种药物对神经干细胞增殖分化的影响；将人参皂苷按所测的最佳浓度加入到神经干细胞单细胞悬液中,培养不同的时间,应用MTT法测定不同时间点人参皂苷对神经干细胞增殖分化的影响。结果筛选出人参皂苷促进神经干细胞增殖分化的最佳浓度为1μg/ml,与对照组相比,差异具有显著统计学意义(P<0.01)；麦冬皂苷D、黄芪甲苷、人参皂苷Re、Rg1、Rb2和Rf促进神经干细胞增殖分化的最佳浓度分别为0.3μg/ml、0.25μg/ml、0.005μg/ml、 0.32μg/ml、0.01μg/ml和0.32μg/ml,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)；人参皂苷从3h开始对神经干细胞的增殖分化起促进作用,与对照组相比,差异具有统计学意义(P<0.05),且作用的最佳时间点为24h。提示人参皂苷、黄芪甲苷、麦冬皂苷D、人参皂苷Re、Rg1、Rb2和Rf均有促进神经干细胞增殖分化的作用,且人参皂苷促进神经干细胞增殖分化的最佳作用时间为24h。3人参皂苷通过调节HIF-1α对缺血再灌注胎鼠海马神经干细胞增殖、分化的作用采用氧糖剥夺／再灌注(OGD/R)细胞模型模拟脑缺血再灌注造成的脑损伤,将体外分离培养的神经干细胞分为9组,共3个时间点,每个时间点分为正常(对照)组、(缺血再灌注)模型组和(缺血再灌注)药物处理组(人参皂苷1μg/ml),正常组细胞正常培养,后两组细胞先缺氧培养4h,再分别正常培养2h、4h、6h,各时间点结束后,应用Western blot检测各组细胞细胞核中HIF-1α蛋白的含量；应用酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组细胞培养上清液中血管内皮生长因子(VEGF)的含量；应用免疫荧光双标染色方法检测各组神经干细胞特异性标志物巢蛋白(Nestin)、神经干细胞增殖标记物(Brdu)、神经元特异性标记物(Tuj-1)及星形胶质细胞标记物(Vimentin)的表达,统计各组阳性细胞的个数、光密度和面密度。结果发现,常氧情况下HIF-1α蛋白和VEGF蛋白表达较少,缺氧以后表达增加,与正常组相比,差异具有统计学意义(P<0.05)；正常组、模型组、药物处理组细胞均有Nestin、Brdu、Tuj-1和Vimentin的表达；复氧2h和复氧4h时间点,模型组与正常组相比,HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量增加,差异具有统计学意义(P<0.05),阳性细胞的细胞个数、光密度和面密度比正常组减少,差异具有统计学意义(P<0.05)；药物处理组与模型组相比,HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量增加,且阳性细胞的细胞个数、光密度和面密度比模型组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05)。复氧6h时间点,模型组与正常组相比,HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量增加,差异具有统计学意义(P<0.05),阳性细胞的细胞个数、光密度和面密度比正常组减少,但减少不明显,差异无统计学意义(P>0.05)；药物处理组与模型组相比,HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量增加,且阳性细胞的细胞个数、光密度和面密度比模型组明显增加,差异具有统计学意义(P<0.05).2h、4h、6h三个复氧时间点,随着复氧时间的延长,模型组和药物处理组HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量逐渐增加,阳性细胞的细胞个数、光密度和面密度也逐渐增加。提示缺血再灌注后,神经干细胞细胞核中HIF-1α基因转录翻译增强,促进了其下游靶基因VEGF的转录翻译增强,使HIF-1α蛋白与VEGF蛋白表达均增加,从而促进了神经干细胞的增殖与分化；人参皂苷可促进缺血再灌注后HIF-1α蛋白和VEGF蛋白含量进一步增加,通过促进神经干细胞的增殖与分化发挥脑保护作用。综上所诉,采用无血清细胞培养方法可在体外成功分离培养Nestin阳性的神经干细胞；人参皂苷、黄芪甲苷、麦冬皂苷D、人参皂苷Re、Rg1、Rb2和Rf均有促进神经干细胞增殖分化的作用,且人参皂苷促进神经干细胞的增殖分化作用的最佳作用时间为24h；人参皂苷可通过调节HIF-1α基因的转录,启动下游目的基因VEGF的转录,通过自分泌和旁分泌的模式作用于神经干细胞,促进其增殖与分化,从而达到修复脑损伤,恢复脑功能的目的。