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背景:骨关节炎（OA）是一种常见的、与年龄相关的、退化性疾病,其主要特征表现为关节软骨完整性的丧失,关节表面不同程度的骨赘生成,以及软骨下骨重塑和滑膜炎。受体相互作用蛋白激酶1（RIPK1）是一种调节细胞死亡和炎症的蛋白,其广泛的表达于四肢、肺、肝和肠等组织中。RIPK1可通过依赖激酶和非依赖激酶两种途径调节细胞凋亡和坏死性凋亡,这对于细胞的命运和炎症状态至关重要。我们课题组在早期实验中发现RIPK1的磷酸化水平在骨关节炎小鼠的关节软骨中较正常对照组低。因为RIPK1的表达水平及其磷酸化水平对骨关节炎是否具有调节作用仍不清楚,所以我们试图研究RIPK1基因在骨关节炎中的作用及其机制。方法:1.取12周龄C57/BL6雄性小鼠于显微镜下切断半月板平台韧带,构建内侧半月板不稳定（DMM）小鼠骨关节炎模型,将假手术组作为对照组。术后一周通过关节腔注射分别给予sh-RIPK1腺病毒和空载腺病毒处理,连续注射八周后处死小鼠。对膝关节组织切片进行番红固绿、HE和免疫组化染色,观察组织形态学改变和炎症相关标志蛋白的表达水平。取新出生3天的C57/BL6乳鼠双侧膝关节软骨细胞进行培养,使用IL-1β（5ng/ml）诱导软骨细胞炎症状态,同时分别给予sh-RIPK1腺病毒、过表达RIPK1腺病毒或空载腺病毒处理48小时。提取细胞蛋白进行Western Blot实验,以检测炎症相关蛋白、TRAF2、MyD88、TRIF的表达水平。使用Elisa试剂盒定量检测细胞培养基中的TNF-α分泌水平。2.使用IL-1β刺激原代软骨细胞,同时使用si-NC、si-MyD88和si-TRIF RNA敲低MyD88和TRIF的表达,0、10、30、60min后检测RIPK1的磷酸化水平;48小时后,使用WB检测炎症相关蛋白的表达水平,确定敲低MyD88和TRIF可以通过抑制RIPK1磷酸化来抑制IL-1β诱导的炎症反应。使用TLR2和TLR3特异性激动剂（Pam3CSK4、Poly（I:C））激活TLR2-MyD88和TLR3-TRIF信号通路,同时使用sh-RIPK1腺病毒敲低RIPK1,48小时后,WB检测炎症相关蛋白的表达水平,确定依赖于MyD88和TRIF的炎症反应需要RIPK1的介导。用IL-1β刺激过表达TRAF2的原代软骨细胞,检测炎症相关蛋白、MyD88、TRIF的表达水平及RIPK1的磷酸化水平,确定TRIF/MyD88-RIPK1-TRAF2负反馈信号通路。3.对DMM和假手术组关节软骨进行免疫组化染色和TUNEL染色,确定骨关节炎模型中是否有凋亡和坏死性凋亡的发生。用IL-1β刺激低表达RIPK1的原代软骨细胞,使用TUNEL染色和WB检测凋亡相关蛋白和坏死性凋亡标志性蛋白的表达水平,确定RIPK1对凋亡和坏死性凋亡过程的影响。使用泛caspase抑制剂Z-VAD和IL-1β共刺激原代软骨细胞,确定凋亡通路对软骨细胞炎症的调节作用。结果:1.我们通过DMM手术成功构建小鼠骨关节炎模型后,发现使用腺病毒敲低RIPK1的表达后,关节表面组织形态明显较造模组完整,OARSI评分也较低;HE染色显示关节滑膜炎症水平明显较造模组轻微;免疫组化结果显示MMP1、MMP3、MMP13等炎症蛋白表达水平也明显降低。体外细胞实验结果和体内动物实验结果一致。同时,sh-RIPK1还降低了TRAF2、MyD88、TRIF的表达水平。2.使用si-MyD88和si-TRIF RNA敲低MyD88和TRIF的表达后,IL-1β诱导的RIPK1的磷酸化水平和炎症相关蛋白的表达水平明显降低。Pam3CSK4、Poly（I:C）可以激活TLR2-MyD88和TLR3-TRIF信号通路并引起炎症相关蛋白的高表达,而使用sh-RIPK1腺病毒敲低RIPK1后可明显阻断该过程。过表达TRAF2可以抑制IL-1β引起的RIPK1的磷酸化,从而抑制MyD88和TRIF的表达,进而抑制MMP1、MMP3、MMP13等炎症蛋白表达。而在过表达RIPK1的软骨细胞中,TRAF2的表达水平明显升高。3.与假手术组相比,DMM组小鼠的坏死性凋亡标志蛋白的表达水平无明显变化,而TUNEL染色的阳性率明显高于假手术组,且可以通过敲低RIPK1的表达来逆转此过程。在细胞实验中,降低RIPK1的表达也可以降低IL-1β介导的凋亡蛋白的表达。同时,使用Z-VAD抑制细胞凋亡水平,也可以抑制细胞炎症相关蛋白的表达水平。结论:1.在体内、外骨关节炎炎症模型中敲低RIPK1的表达可以明显抑制骨关节炎软骨细胞炎症反应。2.RIPK1基因通过TRIF/MyD88-RIPK1-TRAF2负反馈信号通路调节骨关节炎软骨细胞内炎症过程。3.RIPK1基因调控的骨关节炎依赖于凋亡而非坏死性凋亡。