论文部分内容阅读
副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis,HPS)在特定条件下可致猪,特别是断奶仔猪和保育猪发生以多发性浆膜炎、关节炎、脑膜炎为主要特征的副猪嗜血杆菌病,药物防治、疫苗接种等是常用的防治该病的方法。然而,各类抗生素不合理的长期使用致使HPS的耐药性日益增强;同时由于HPS血清型复杂,相互间缺乏交互免疫性,且具有明显的地方特征,目前仅有的一些商品化灭活疫苗很少或不能产生交叉保护。因此研制具有良好免疫性,尤其是能诱导产生交互免疫保护力的新型疫苗具有重要的现实意义。本实验室前期的研究结果显示,HPS血清型13型转铁结合蛋白A(TbpA)不仅对于相同血清型菌株攻毒的豚鼠具有良好的免疫活性,还可以对不同血清型菌株(血清型4型)提供一定的交叉保护力,但其他血清型HPS的TbpA能否针对不同血清型提供交互免疫保护尚不明确。本研究系在前期研究的基础上,利用表达的HPS血清型4、13型重组TbpA免疫豚鼠,通过检测免疫后豚鼠血清中抗体水平和细胞因子(肿瘤坏死因子TNF-α,干扰素IFN-γ,白细胞介素IL-2、IL-5、IL-8,趋化因子MCP-1)水平,观察攻毒后豚鼠的采食量、精神状态及死亡率,剖检病变及其病理组织学变化,探究HPS不同血清型的TbpA对豚鼠的交互免疫保护作用,从而为后期在本动物(仔猪)上进一步开展相关研究奠定基础。首先,Reed-Muench(累积法)测定HPS血清型4、13型对HPS抗体阴性豚鼠的半数致死量(LD50)。其次,筛选54只健康的40日龄HPS抗体阴性雌性豚鼠,每组随机分配6只,共9组;A1、A2组以100μg/只免疫HPS血清型4型TbpA;B1、B2组以100μg/只免疫HPS血清型13型TbpA;C1、C2组以200μL/只注射PBS作为攻毒对照组;A3、B3、C3组以200μL/只注射PBS作为空白对照。采用弗氏佐剂,背部皮下多点注射,免疫两次,每次免疫剂量相同,间隔时间20天。每次免疫后10天心脏采血分离血清,检测血清中抗体和细胞因子(IL-2、IL-5、IL-8、IFN-γ、TNF-α、MCP-1)含量。在第2次免疫后21天,A1、B1、C1以HPS血清型4型1×LD100剂量进行攻毒,A2、B2、C2以HPS血清型13型1×LD100剂量进行攻毒,A1、B1、C1注射等量PBS,统计免疫保护率,剖检豚鼠,制作病理组织切片观察比较病理变化。结果显示,豚鼠在免疫HPS血清型4、13型TbpA后,血清中抗体水平均有所升高,二免后均上升显著,但两者之间差异不显著;除MCP-1外,5种细胞因子水平在两次免疫后均显著上升,且两次免疫之间差异显著,但免疫血清型4和13型TbpA组之间差异不显著;血清型4型TbpA免疫组对同血清型和不同血清型HPS的攻毒保护率为66.7%和50%;血清型13型TbpA免疫组对同血清型和不同血清型HPS的攻毒保护率为81.3%和50%;免疫攻毒组存活豚鼠和空白对照组豚鼠均未见明显肉眼病变和病理组织变化,而死亡豚鼠肺脏出血、坏死,肝脏表面纤维素性渗出,胸腔、腹腔积液,胸腔粘连,脑出血,肺脏、脾脏、肝脏均有少量炎性细胞浸润或轻微出血;攻毒对照组豚鼠肺脏出血、坏死,肝脏表面纤维素性渗出,胸腔粘连,胸腔、腹腔积液,脑出血,肺脏、脾脏、肝脏有大量炎性细胞浸润,且出血严重。结果表明,HPS血清型4、13型TbpA蛋白均能够为同型和不同型的HPS提供交互免疫保护力;血清型13型TbpA对同血清型HPS的免疫保护率高于血清型4型,血清型4、13型TbpA对不同血清型HPS的免疫保护率基本相同。