重庆市动物源金黄色葡萄球菌耐药性分析及ESBLs与肠毒素基因的检测

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金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)属于葡萄球菌属,是一种重要的人兽共患革兰氏阳性菌,广泛存在于动物和人的呼吸道、消化道、体表等部位。金黄色葡萄球菌有多种感染途径,不同感染途径导致的临床症状也不同。经消化道感染引起食物中毒和胃肠炎;经体表感染可以引起化脓性疾病,且可恶化为败血症;经呼吸道感染可引起支气管炎和肺炎。在兽医临床上常造成乳房炎、关节炎、脐炎、局部脓肿等疾病;也可引起人的皮肤化脓和败血症。其产生的肠毒素还是造成人类食物中毒的一大元凶,据统计,在美国由金黄色葡萄球菌肠毒素引起的食物中毒占33%,加拿大占45%,引起严重的公共卫生问题。自1961年Eriksen检出第一株耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus,MRSA)开始,关于金黄色葡萄球菌对各种抗菌药物耐药的报道越来越频繁,至今已经出现耐环丙沙星、红霉素、庆大霉素、四环素、万古霉素等的耐药菌株,特别是多重耐药现象越来越严重,由此造成的一系列公共卫生问题已成为全世界关注的焦点之一。为了解重庆市动物源性金黄色葡萄球菌的耐药情况、携带超广谱β-内酰胺酶(Extended-spectrumβ-lactamases,ESBLs)基因以及肠毒素基因等流行的基本情况,本研究于2014.03-2017.12采集重庆市部分猪场、鸡场、奶牛场、山羊场、兔场的共1371份样品进行金黄色葡萄球菌的分离鉴定,将样品经前处理后加入Mueller-Hinton高盐培养基中进行增菌,随后用接种环蘸取菌液划线接种于甘露醇氯化钠平板,挑取疑似菌落于LB液体培养基进行扩大培养,随后用水煮法提取细菌基因组,以此为PCR模板扩增金黄色葡萄球菌特异性基因nuc,确认是否为金黄色葡萄球菌。根据美国临床和实验室标准协会(CLSI)抗菌药物敏感性试验标准,采用K-B纸片法对鉴定为金黄色葡萄球菌的临床分离株进行药物敏感性试验,检测重庆市动物源金黄色葡萄球菌细菌耐情况。使用试剂盒提取细菌质粒,通过PCR方法检测菌株中是否携带blaTEM、bla CTX-M、blaSHV、blaOXA-2、blaOXA-10、blaVEB、blaPER和blaGESES 8种ESBL基因,对PCR产物进行测序,对测序结果使用DNAstar软件进行分析,确定其ESBL基因亚型;采用多重PCR方法对分离菌株进行20种肠毒素基因型的检测,解析重庆市动物源金黄色葡萄球菌中流行的肠毒素基因型。结果从1371份样品中分离到89株金黄色葡萄球菌,金黄色葡萄球菌总体分离率较低为6.5%,其中兔场分离率最高达15.2%,牛场分离率最低仅为1.7%。89株金黄色葡萄球菌包括25株猪源菌株、32株鸡源菌株、6株牛源菌株、10株羊源菌株和16株兔源菌株,分离率分别为7.3%、6.7%、1.7%、11.4%、15.2%。样品中金黄色葡萄球菌分离率最高为大足区22.6%,其次为北碚区、长寿、垫江、沙坪坝、荣昌、璧山、彭水、和渝北,其样品金黄色葡萄球菌分离率分别为:11.4%、7.3%、6.7%、6.7%、6%、5.2%、4.6%和2%,最低的为合川分离率为1%。89株菌对24种抗菌药物均有不同程度耐药,其中对青霉素类药物耐药最为严重,其次为四环素类、大环内酯类和喹诺酮类。从菌株来源来看,猪源和鸡源菌株的耐药情况较羊源、牛源和兔源菌株严重。北碚、荣昌、垫江地区菌株耐药情况相比其他地区耐药谱较广且耐药率高。所有分离菌均为多重耐药,耐药数量从1种到21种药物不等,猪源菌株的多重耐药最为严重,兔源菌株的多重耐药性最低。北碚、璧山、大足、彭水、渝北、长寿等地区的菌株多重耐药性主要集中在10种药物以下,而荣昌、沙坪坝等地区的菌株主要为耐10种药物以上,彭水与合川地区菌株的多重耐药分布较广,彭水地区多重耐药从3-18种药物不等。ESBL基因检测结果仅检测到TEM型ESBL基因,未检测到其他7种ESBL基因型,经测序分析,发现所携带的均为bla TEM-1a基因,86株菌株携带该基因,携带率达96.6%。通过对89株金黄色葡萄球菌肠毒素基因的多重PCR检测发现有88株菌株均检测到肠毒素基因,肠毒素基因检测阳性率达98.9%,本试验有30株菌检测到SEA-SEE传统肠毒素基因,且主要为sec和sed,88株菌菌检测到新型肠毒素,且主要流行肠毒素seg、sei、tst-1等基因,本次试验未检测到selq基因;其中sea和seb基因仅在鸡源菌株和牛源菌株种检测到,selr仅在牛源菌株和兔源菌株种检测到,seg、sei、selj、selk、selo、tst-1、sell在5种来源菌株中均有检测到。不同地区之间金黄色葡萄球菌肠毒素基因检出呈现一定的集中趋势;不同动物源菌株所携带的肠毒素基因类型存在一定的差别,鸡源菌株携带肠毒素基因种类最多达17种,兔源菌株最少为11种;从每个菌株携带肠毒素基因情况来看,仅一株兔源菌株未检测到肠毒素基因,1株猪源菌株携带肠毒素基因数量最多达10种,其余菌株携带肠毒素基因1-9种不等。本试验结果表明重庆市动物源金黄色葡萄球菌分离菌株总体耐药情况严重,对青霉素类耐药率达90%以上,且多重耐药现象严重,其中猪源菌株较其他几种动物来源菌株耐药情况严重,荣昌、沙坪坝地区分离菌株多重耐药情况较严重;ESBL基因检测结果发现重庆市金黄色葡萄球菌广泛携带blaTEM-1a型ESBL基因。肠毒素基因携带情况较严重,且主要流行seg、sei等新型肠毒素基因,传统肠毒素基因检出率较小。
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