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前言 自体静脉旁路移植术是临床上治疗动脉阻塞性疾病的重要手段，常用于冠心病和动脉硬化闭塞症的血管重建。但由于内膜增生(Intimal hyperplasia，IH)及后期的动脉硬化所导致的移植段血管中远期狭窄和闭塞，移植术后1年移植段血管阻塞率为10％-40％，而十年阻塞率可达50％-60％。所以，IH的发病机制及临床防治是当前国内外众多学者的研究热点。其中血管平滑肌细胞(Vascular smooth muscle cell，VSMC)向内膜迁移并过度增殖是其病变演变的重要环节。而VSMC的增殖，则有赖于细胞周期的进入和进行。细胞周期中有两个关键转折点：一是G1期进入S期，称为“起始点”，位于G1末期，此时DNA开始合成；二是G2期进入M期，称为“进入点”，位于M期起始部位，此时细胞开始分裂。近年来对细胞周期的研究取得了许多突破性进展，发现并确立了细胞周期素(Cyclin)、细胞周期蛋白依赖激酶(Cyclin dependent kinase，CDK)和细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子(Cyclin dependent kinase inhibitor，CKI)在真核生物细胞周期调控中的重要作用。而CDK表达及活性的调控是细胞周期调控的核心，其中CDK2和CDK4主要作用于G1期和S期，具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用。本实验中，我们应用RT-PCR方法和免疫组织化学方法研究细胞周期中G1／S期最具有代表性的CDK2、CDK4在移植血管不同时期的表达情况，探讨其对自体移植静脉SMC增殖和IH的作用。为自体移植静脉的再狭窄的防治提供一些依据和思路。 实验材料与方法 本实验模拟临床上自体静脉旁路移植术，通过间置移植大鼠颈内静脉于同侧颈总动脉建立雄性Wistar大鼠自体静脉移植动物模型，50只雄性Wistar大鼠按照术后取材时间不同随机分为5组：分别于术后1、2、3、7天及14天取移植静脉，同时取对侧正常静脉作为空白对照。观测各组标本的下述指标：行HE染色和Verhoeff-Van Gieson(VVG)染色，进行形态学观察，计算机图象分析仪计算内膜平均厚度;SABC法CDKZ、CDK4免疫组化染色，计算阳性细胞百分率;RT一PCR观察CDKZ、CDK4mRNA表达，组织匀浆，苯酚/异硫氰酸肌法提取总RNA，进行反转录合成cDNA，以日一ac血为内对照进行PCR扩增，扩增产物进行电泳于凝胶自动成像仪1 D Kodak上自动成像，应用Gelworks 1 D Advanced软件进行结果定量分析。采用SPSS 10 .0 for Windows软件进行统计学分析，以P<0 .05为差异有统计学意义。实验结果 (1)光学显微镜观察:移植后1周，移植血管开始出现内皮化，移植静脉仍可见内皮细胞脱落，内膜增厚明显，与移植后3天内差异有显著性(P<0.05)。新生内膜中出现VSMC。内膜厚度与管壁厚度基本达到高峰。(2)免疫组织化学观察:在正常细胞中仅有少量CDKZ、CDK4阳性表达，移植静脉中CDKZ、CDK4阳性细胞表达移植后2天，阳性细胞表达明显增加，至1周时达到高峰，与移植后2天以内相比，差异有显著性(P<0.05)。(3)RT-PCR检测移植静脉中CDKZ、CDK4基因mRNA表达的变化:CDKZ、CDK4基因mRNA的表达产量自术后第二天普遍高于内对照p一actin表达产量，静脉移植术后7d一14d为CD心、CDM基因mRNA表达的高峰，与移植后3天以内相比，差异有显著性(P<0.05)。讨论 移植静脉IH是一个多因素、多途径共同参与的复杂病理过程，中膜VSMC的迁移和增殖是IH形成的核心环节和必要条件。任何细胞发生增殖均要经过细胞周期，细胞增殖周期的完成依赖于某些特殊激酶的表达和激活来实现的，这种激酶被称为周期蛋白依赖性激酶(cyclin一dePendentkinases CDK)，是细胞周期调控网络的中心分子。细胞周期中有两个关键转折点:一是G1期进人S期，称为“起始点”，位于Gl末期，此时DNA开始合成;二是G2期进入M期，称为“进人点”，位于M期起始部位，此时细胞开始分裂。CDKZ和CDK4主要作用于Gl期和S期，具有启动DNA复制和诱发有丝分裂的双重作用。检测结果表明了CDKZ、CDK4基因在移植静脉早期表达就开始增加，且与移植后内膜增生的病理过程一致，在l一2周达到高峰，说明了CDKZ、CDK4基因在移植静脉内膜增生的病理过程中可能起到了重要作用。CDKZ、CDK4基因共同表达增加，也说明了细胞周期的推进和内膜增生是多种基因相互作用的结果，多基因多环节的联合基因治疗可能是今后的研究方向。结论 1.移植后1周，内膜增厚明显，新生内膜中出现VSMC，内膜厚度与管壁厚度接近高峰。术后2周，内膜仍有进一步增厚的趋势。 2.CDKZ、CDK4蛋白和mRNA在移植静脉早期表达就开始增加，在1一2周达到高峰。 3.CDKZ、CDK4基因在移植静脉内膜增生过程中可能起到重要作用，防治抑制IH的发生和发展CDKZ、CDK4基因可能是有希望的靶基因。