背景与目的异常表达的表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)引起的细胞信号通路持续活化在维持细胞恶性表型和肿瘤进展中占有重要地位,为靶向EGFR治疗肿瘤提供了依据。EGFR抑制剂包括单克隆抗体和小分子酪氨酸激酶抑制剂,其中属于酪氨酸激酶抑制剂的吉非替尼(Gefitinib,ZD1839,Iressa?)已应用于临床不同类型的肿瘤。尽管小部分患者从中取得令人鼓舞的疗效,但大多数患者未明显受益,表明这部分患者对治疗存在着原发性或继发性的耐受,而EGFR表达似乎不能完全反映肿瘤细胞或组织对药物的反应性,这些资料充分体现了调控EGFR信号通路治疗肿瘤比我们之前预期的更为复杂和艰难。结肠癌较高的发病率和死亡率已经使其成为全球范围内主要的恶性肿瘤之一,已证实EGFR在结肠癌中的表达和活性增高,但是对预测患者预后和吉非替尼敏感性的价值尚不明确。体内外的研究已表明吉非替尼对结肠癌细胞有不同程度的抗肿瘤活性,然而在I/II期临床研究中,并没有观察到吉非替尼单药治疗进展期结肠癌患者有明显疗效,也没有显著提高化疗药物氟尿嘧啶或伊利替康(Irinotecan , CPT-11)的疗效,这样就限制该药在临床上的应用。因此,揭示吉非替尼的耐受机制,选择可受益的患者接受吉非替尼治疗,可望改善临床有效率。肿瘤细胞膜上除了EGFR家族受体外,还有许多其他的生长因子受体,如胰岛素样生长因子1型受体(insulin-like growth factor receptor-1,IGFR-1)、肝细胞生长因子受体(hepatocyte growth factor receptor,MET)等,与EGFR具有不同程度的同源性,同时也具有酪氨酸激酶的活性,均可激活相似效应的细胞信号通路。研究已表明IGFR-1和MET在结肠癌中表达增高,而且与肿瘤细胞生长、分化密切相关。另外,细胞信号通路的网络性决定了酪氨酸激酶受体之间的相互作用(crosstalk),因此在吉非替尼耐受机制的研究中势必要关注其他细胞膜受体。EGFR与相应配体结合后形成二聚体或异二聚体并被激活,使位于细胞内的受体区域自动磷酸化,为细胞内的信号蛋白提供磷酸结合位点,从而激活细胞内多种信号通路的连锁级联效应(主要是PI3K/Akt通路和Ras/Raf/MAPK通路),促进肿瘤细胞增殖和抑制凋亡。吉非替尼与ATP竞争性结合EGFR细胞内酪氨酸激酶域,阻止受体磷酸化,抑制EGFR激活的多条信号通路。然而目前越来越多的研究表明EGFR下游信号通路中的蛋白持续性活化,不被吉非替尼所抑制,导致细胞继续生长繁殖,进而引起肿瘤抗拒吉非替尼作用。本研究观察6种结肠癌细胞株在体外对吉非替尼的敏感性,分析EGFR和下游信号通路蛋白的基础(baseline)表达及其活性与吉非替尼敏感性的关系;检测吉非替尼作用下敏感性不同的细胞EGFR和下游信号通路的活化状态;观察与EGFR相关的IGFR-1和MET的表达及其活性与吉非替尼敏感性的关系;探讨结肠癌细胞耐受吉非替尼的机制并以此进行逆转细胞耐受表型的研究。方法1、应用免疫细胞化学和RT-PCR分别检测6种结肠癌细胞中EGFR蛋白和mRNA的表达。2、体外药物敏感性实验(MTT法)观察在有或无EGFR的配体-表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)刺激状态下吉非替尼对结肠癌细胞的生长抑制率,并计算出半量抑制浓度(50% inhibition concentration,IC50)。3、以Western blot检测EGFR和下游信号通路蛋白的基础表达及其活性,以及在吉非替尼作用下各蛋白的表达及其活化状态。4、应用流式细胞术检测吉非替尼对结肠癌细胞周期和凋亡的影响。5、以Western blot检测与EGFR相关的其他酪氨酸激酶受体IGFR-1和MET的基础表达及其活性,以及在吉非替尼作用下的表达和活化状态,以RT-PCR检测相应配体的mRNA表达。6、采用相应的受体酪氨酸激酶抑制剂阻断IGFR-1或MET活性,以Western blot检测与EGFR共同的下游信号通路的活化状态。7、以免疫共沉淀法和Western blot检测受体之间的相互作用以及受体与下游信号通路蛋白的作用。8、进行逆转细胞耐受表型的研究,通过MTT法和流式细胞术评价生长抑制效应。9、以Western blot检测AKT和MAPK共同的下游信号蛋白激酶-糖原合成酶激酶3β(glycogen syntheses kinase 3β,GSK-3β)的活化状态;以GSK-3β抑制剂氯化锂(lithium chloride,LiCl)阻断其活性,MTT法观察LiCl对受体酪氨酸激酶抑制剂诱导的生长抑制有无影响;以免疫荧光激光共聚焦显微镜观察受体酪氨酸激酶抑制剂诱导的有活性的GSK-3β表达及其核转位。10、收集结肠癌手术标本,提取总蛋白,以Western blot检测EGFR和IGFR-1或MET的基础表达及其活性,了解它们在结肠癌组织和相匹配的癌旁正常组织中的表达状况,分析它们在结肠癌组织中的表达有无相关性以及与临床病理特征的关系。结果1、6种结肠癌细胞EGFR蛋白和mRNA的表达状况: Lovo、HCT116、HT29、LS174T和SW480均有不同程度表达,其中Lovo表达最强,而SW620不表达。2、Lovo细胞对吉非替尼最为敏感,HT29和SW480次之,HCT116、LS174T和SW620敏感性最差:当吉非替尼作用浓度为1μmol/L时,Lovo细胞生长抑制率(10%FBS生长状态下34%,EGF刺激状态下37%)远远高于其他5种结肠癌细胞(P<0.05);Lovo细胞对吉非替尼最为敏感,其IC50<10μmol/L,HT29和SW480敏感性居中,10μmol/L <IC50<100μmol/L,HCT116、LS174T和SW620敏感性最差,IC50>100μmol/L;各细胞在FBS生长状态和EGF刺激状态下组间的抑制率、IC50的差异不明显(P>0.05)。3、结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性在某种程度上可能与EGFR基础表达及其活性有关,但不能完全决定敏感性的高低:Lovo细胞的敏感性最好,EGFR表达及其活性最高,提示EGFR表达及其活性可能与敏感性有关;HCT116、LS174T虽然有EGFR表达,但与不表达EGFR的SW620细胞比较,对吉非替尼的反应性均表现出相同程度的耐受。另外,HT29、SW480的敏感性居中,EGFR表达却与耐受型HCT116、LS174T的无明显差异,故结肠癌细胞对吉非替尼的反应性不能完全由EGFR表达及其活性决定;而AKT、MAPK的表达及其活性以及PTEN的表达在吉非替尼敏感细胞和耐受细胞之间无显著差异。4、结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性与细胞生长对EGFR的依赖性以及EGFR和下游信号通路的伴随性相关:首先,在EGF刺激下,Lovo和HT29细胞的EGFR活性明显增高(P<0.05),而HCT116仅轻微增高。Lovo和HT29细胞的AKT、MAPK活性明显增高(P<0.05),而HCT116的活性无明显变化,提示在Lovo和HT29细胞中EGFR/AKT、EGFR/MAPK轴具有良好的完整性,即细胞生长依赖于EGFR,而HCT116细胞耐受吉非替尼与细胞生长对EGFR的不依赖性有关;其次,在吉非替尼作用下,Lovo细胞中EGFR表达明显下降,同时活性被阻滞(P<0.05),AKT、MAPK表达无明显变化,但活性明显被抑制,且效应随剂量升高而递增(P<0.05)。HT29细胞中EGFR、AKT和MAPK表达基本无改变,EGFR活性明显被阻断(P<0.05),但AKT、MAPK活性未随之被抑制(P>0.05)。HCT116细胞中EGFR、AKT和MAPK表达无改变,EGFR活性降低不如Lovo和HT29明显,AKT、MAPK的活性也未被抑制。结果提示HT29、HCT116细胞对吉非替尼的敏感性降低与EGFR和下游信号通路的不伴随性(uncoupling)有关。在吉非替尼作用下,Lovo、HT29和HCT116细胞的PTEN表达均无明显变化。5、吉非替尼诱导的生长抑制作用可通过调控细胞周期和凋亡:10μmol/L吉非替尼作用于结肠癌细胞,Lovo细胞G1期比例从(59.49±1.74)%明显增加到(76.25±3.01)% (P<0.05),S期和G2期细胞比例相应降低,细胞凋亡率从(1.97±0.35)%明显增加至(42.68±4.18)% (P<0.05);HT29细胞G1期比例和凋亡率仅轻度上升;HCT116细胞均无明显增加。6、IGFR-1β活性增高与结肠癌细胞耐受吉非替尼有关:首先,IGFR-1β基础表达与结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性无关,而IGFR-1β活性在Lovo、HT29和SW480较弱(Lovo细胞的活性似乎更弱),而在HCT116、LS174T和SW620的活性较强(P<0.05)。MET基础表达及其活性与吉非替尼敏感性无明显关系。结果提示IGFR-1β基础活性增高与结肠癌细胞耐受吉非替尼有关;其次,在吉非替尼作用下,Lovo细胞IGFR-1β表达及其活性变化不明显,HT29细胞IGFR-1β表达无改变,但其活性明显升高(P<0.05), HCT116细胞的IGFR-1β表达及其活性无明显变化。结果提示结肠癌细胞在吉非替尼作用下IGFR-1β活性增高与吉非替尼敏感性降低有关;最后,在吉非替尼作用下,HT29细胞中IGFR-1β的配体IGF-II的mRNA表达水平明显增高(P<0.05),Lovo和HCT116无明显变化。结果提示HT29细胞在吉非替尼作用下IGFR-1β蛋白表达无明显变化,因自分泌IGF-II增加而IGFR-1β活性增强。7、IGFR-1β酪氨酸激酶抑制剂AG1024可明显降低HT29、HCT116细胞中AKT和MAPK的活性并逆转细胞的耐受表型:AG1024对Lovo细胞EGFR、IGFR-1β、AKT和MAPK的表达及其活性均无明显影响(P>0.05)。AG1024可降低HT29细胞IGFR-1β活性,但不能明显抑制AKT和MAPK的活性,而联合吉非替尼作用于细胞AKT和MAPK的活性显著被抑制(P<0.05)。AG1024可阻断HCT116细胞IGFR-1β活性,AKT和MAPK的活性也随之显著被抑制(P<0.05),联合吉非替尼AKT和MAPK的活性受抑制与单独应用AG1024的差异不明显(P>0.05)。提示AG1024单独和联合吉非替尼可相应抑制HCT116和HT29细胞中AKT、MAPK的持续活化;联合吉非替尼和AG1024使HT29细胞增殖率显著下降,细胞G1期阻滞,凋亡增加(P<0.05)。AG1024作用于HCT116细胞可降低增殖率,细胞G1期阻滞,凋亡增加( (P<0.05),但联合吉非替尼并未进一步增加抑制效应(P>0.05)。结果提示AG1024可逆转细胞耐受表型。8、结肠癌细胞耐受吉非替尼可通过EGFR/IGFR-1β的相互作用并激活它们共同的下游信号蛋白AKT和MAPK:Lovo细胞中EGFR和IGFR-1β无结合,吉非替尼作用下EGFR结合AKT、MAPK减少(P<0.05);HT29细胞在吉非替尼作用下EGFR和IGFR-1β结合,联合AG1024使AKT、MAPK与EGFR结合明显减少(P<0.05);HCT116细胞中EGFR和IGFR-1β结合,AG1024作用下与AKT、MAPK结合减少(P<0.05)。9、吉非替尼和AG1024诱导的结肠癌细胞生长抑制依赖于激活GSK-3β:Lovo细胞在吉非替尼作用下GSK-3β活性增强,而在其余5种细胞中变化不明显;HT29细胞在吉非替尼联合AG1024作用下GSK-3β活性明显增强(P<0.05),HCT116细胞在AG1024作用下活性也显著增强(P<0.05);同时给予LiCl抑制GSK-3β活性则明显降低吉非替尼和AG1024诱导的生长抑制效应(P<0.05);结肠癌细胞在吉非替尼和/或AG1024作用下,活化的GSK-3β出现明显的核转位。10、结肠癌组织中EGFR表达率为55.6%(10/18),癌旁正常组织为37.5%(3/18),肿瘤组织中有高表达的趋势;p-EGFR(EGFR活化形式)在结肠癌组织表达率为33.3%(6/18),较正常组织的5.6%(1/18)明显增高(P<0.05);p-IGFR-1β(IGFR-1β活化形式)在结肠癌组织表达率为44.4%(8/18),较正常组织的11.1%(2/18)明显增高(P<0.05);EGFR与p-EGFR的表达无相关性(r = 0.228, P>0.05),p-EGFR与p-IGFR-1β的表达也无明显相关(r = -0.127, P>0.05);EGFR、p-EGFR表达与各临床病理参数之间无明显关系(P>0.05),但p-IGFR-1β在淋巴结转移的患者中表达显著增高(P<0.05),而且在分期晚的患者中也可观察到这种趋势。结论1、6种结肠癌细胞中Lovo细胞对吉非替尼的敏感性最好,HT29和SW480的敏感性居中,HCT116、LS174T和SW620敏感性最差。2、结肠癌细胞对吉非替尼的敏感性在某种程度上可能与EGFR基础表达及其活性有关,表达和活性高则敏感性好,但不能完全决定敏感性的高低。3、结肠癌细胞HCT116耐受吉非替尼主要表现为细胞生长对EGFR的不依赖性,HT29细胞则表现为EGFR和下游信号通路的不伴随性,IGFR-1β活性增高可能是造成这种不依赖性和不伴随性的原因。4、结肠癌细胞耐受吉非替尼的机制之一可能是通过EGFR和IGFR-1β结合形成异二聚体激活IGFR-1β信号通路,IGFR-1β组成性活化(constitutive activation)与EGFR共同的下游信号AKT和MAPK。5、IGFR-1β酪氨酸激酶抑制剂AG1024可逆转HCT116细胞的耐受表型,联合吉非替尼则可逆转HT29细胞的耐受表型。6、吉非替尼和AG1024诱导的结肠癌细胞生长抑制依赖于激活GSK-3β,检测GSK-3β活性可在早期阶段反映结肠癌细胞对治疗的反应性。7、结肠癌组织中EGFR和IGFR-1β活性明显增高,EGFR表达与EGFR活性无明显相关性,IGFR-1β活性增高可能预示结肠癌患者有较高的转移风险。