恶性淋巴瘤(malignant lymphoma，ML)是原发于淋巴结或淋巴结外组织或器官的一种恶性肿瘤，来源于淋巴细胞或组织细胞的恶变。根据临床和病理特点不同，ML分为两个大类，即霍奇金病(Hodgkin disease，HD)和非霍奇金淋巴瘤(nonHodgkin lymphoma，NHL)，其中B细胞来源的淋巴瘤是B细胞淋巴瘤。在临床上，目前对B细胞淋巴瘤的治疗方法主要是放疗化疗。尽管放疗化疗对B淋巴瘤疗效较好，但对数月或数年之后的复发几乎没什么疗效。大剂量的放疗化疗虽然可以长期消除肿瘤，但由于其毒性较高却造成了更高更早的死亡率，因此出现了一些新的治疗方法。随着分子生物学和免疫学的飞速发展，肿瘤生物治疗学也得到了飞速发展。B淋巴瘤新的治疗方法，有重组人α干扰素，CD20、CD19、CD22的靶向性单克隆抗体及抗肿瘤疫苗等。B细胞淋巴瘤表面抗原的存在，使得淋巴瘤的免疫靶向治疗得以实现。B淋巴瘤细胞逃避免疫系统的一个重要原因是缺少活化T细胞的共刺激分子。近年来的研究着重于改变B淋巴瘤的表型从而使T细胞更好地识别它们，其中一个途径是B淋巴瘤的基因修饰，研究较多的是转入CD40L分子的基因。Briones J等用腺病毒介导的CD40L转染B淋巴瘤细胞，灭活该瘤细胞作为B细胞淋巴瘤的疫苗，得到很好的预防肿瘤的效果。研究发现，CD40L可提高B细胞做为抗原提呈细胞(APC)的能力，可以上调细胞表面共刺激分子(CD80、CD86、ICAM-1、LFA-3)的表达，它们在T细胞活化中起重要作用。LIGHT是近年来发现的肿瘤坏死因子超家族成员，与CD40L同属于一个家族，因此可能具有与CD40L类似的作用。已有研究发现LIGHT可诱导人B细胞白血病细胞一些表面刺激分子的表达，从而提高其抗原提呈能力。LIGHT全称为T细胞上可诱导表达的，与HSV(单纯疱疹病毒)的糖蛋白D竞争结合HVEM的淋巴毒素类似物(homologous to lymphotoxins，exhibits inducible expression，competes with herpes simplex virus glycoprotein D for HVEM，a receptor expressed by T lymphocytes，LIGHT)，可表达于活化的T淋巴细胞，NK细胞和未成熟DCs(iDCs)上，有三个配体HVEM／TR2、LTβR、TR6，与不同的配体结合可发挥不同的生物学功能。LIGHT可表达于具有共刺激T淋巴细胞、诱导DCs成熟及诱导细胞凋亡的功能。LIGHT与其配体HVEM组成一对共刺激分子，为T细胞的激活提供第二信号，激活T细胞，诱导CTL反应，可能具有较强的抗肿瘤效应。日本科学家Tamada K等证实，在抗CD3抗体存在的情况下，LIGHT能以CD28非依赖的方式激活T淋巴细胞并显著诱导Th1型细胞因子IFN-γ和GM-CSF的产生。LIGHT还可作用于NK细胞而间接发挥抗肿瘤效应。在肿瘤组织，LIGHT与NK细胞表面受体HVEM结合，促进了NK细胞的激活、分化和IFN-γ的分泌，分泌的IFN-γ诱导了针对肿瘤抗原的CTL反应。LIGHT可与肿瘤基质细胞上的受体结合，诱导趋化因子CCL21的表达，进而趋化CD8~+T淋巴细胞到肿瘤组织，发挥抗肿瘤效应。Mig和IP-10是重要的抗肿瘤血管生成的趋化因子成员，LIGHT可诱导它们的表达，通过抑制肿瘤血管的形成而发挥抗肿瘤效应。LIGHT还可以诱导肿瘤细胞的凋亡，诱导的凋亡与肿瘤细胞上表达的受体有关，如表达HVEM和LTβ受体的MCF-7，HT29，HT3细胞等。Rooney等认为，在LIGHT的作用下，只表达LTβR的肿瘤细胞也可发生凋亡。LIGHT和LTβR结合，可招募TRAF2、3(TNFR associated factors)，激活NF-κB和JNK／AP-1信号通路，诱导细胞凋亡。此外，LIGHT还可协同IFN-γ诱导肿瘤细胞的凋亡。因此LIGHT可能在抗肿瘤作用研究中具有重要的应用前景。本文的主要目的是研究腺病毒介导的LIGHT对B细胞淋巴瘤的抗肿瘤作用及免疫机理，观察瘤内注射LIGHT腺病毒对小鼠A20淋巴瘤模型的治疗作用以及转染LIGHT的A20细胞制备的疫苗对肿瘤的免疫保护作用。BALB／c小鼠右腹部皮下注射A20细胞建立B淋巴瘤模型，瘤内注射腺病毒Ad LIGHT进行治疗，证实Ad LIGHT可显著抑制肿瘤生长并延长小鼠生存期，诱导机体产生特异性和非特异性的抗肿瘤免疫反应。用灭活的转染了LIGHT腺病毒的A20细胞(小鼠B淋巴瘤细胞)制备成肿瘤疫苗免疫小鼠，可明显抑制A20淋巴瘤再次攻击后的肿瘤生长，诱导出针对A20的特异性CTL反应，证实LIGHT修饰的该疫苗可激发机体对A20淋巴瘤的免疫保护作用。本研究分体外实验和体内实验两部分：第一部分：腺病毒介导的LIGHT对A20细胞的感染及其生物学活性的鉴定我们首先用重组腺病毒Ad LIGHT及对照病毒Ad LacZ感染A20细胞，应用RT-PCR检测了LIGHT在mRNA水平上的表达，用Western Blot检测了LIGHT在蛋白水平上的表达。结果显示，腺病毒携带的LIGHT能在A20细胞中有效地表达。在我们的实验中研究发现，在抗小鼠CD3存在的情况下，感染了Ad LIGHT的A20细胞能够有效刺激T淋巴细胞的增殖并诱导IFN-γ的分泌，且Ad LIGHT具有刺激T淋巴细胞增殖的作用。我们用流式检测了感染LIGHT腺病毒的A20细胞表面分子的表达情况以及凋亡情况。结果发现，Ad LIGHT可以诱导细胞表面分子ICAM-1、Fas的表达，从而提高A20细胞的抗原提呈功能和诱导肿瘤细胞凋亡能力；Ad LIGHT腺病毒诱导了A20细胞的凋亡。第二部分：腺病毒介导的LIGHT对小鼠B淋巴瘤的抗肿瘤作用研究首先我们研究了LIGHT基因修饰的A20淋巴瘤细胞制备的瘤苗对肿瘤攻击的预防作用。Ad LIGHT，Ad LacZ转染A20细胞，并设PBS为对照，丝裂霉素灭活，将灭活的A20细胞(A20／LIGHT、A20／LacZ、A20／PBS)皮下注射至BALB／c小鼠什么部位，并设PBS为对照。对小鼠免疫两次，免疫后7天，对侧腹部皮下注射活的A20细胞，观察成瘤情况和生存期，结果发现，与PBS和Ad LacZ对照组相比，应用A20／LIGHT进行预防，能够有效地抑制肿瘤的生长并延长了荷瘤小鼠的生存期。我们还检测了免疫后10天小鼠的CTL杀伤活性与NK活性，结果发现，用A20／LIGHT免疫的小鼠其脾细胞的NK和CTL活性均有提高，说明转染了AdLIGHT的A20细胞比未曾修饰的A20细胞更能有效地增强针对A20的特异性CTL反应以及提高NK细胞的杀伤活性，从而增强其抗肿瘤作用，诱发机体针对A20淋巴瘤的免疫保护作用。其次我们研究了Ad LIGHT腺病毒瘤内注射对小鼠B淋巴瘤的治疗作用及其免疫机理。收集对数生长期的A20细胞，注射至BALB／c小鼠右腹部皮下，建立B淋巴瘤模型，7天后随机分为3组，瘤内注射腺病毒Ad LIGHT(2×10~8 PFU病毒／100μl／只)进行治疗，并设Ad LacZ和PBS为对照组。对小鼠共治疗三次，每星期治疗一次。我们用游标卡尺测量肿瘤大小并观察荷瘤小鼠的生存期，结果发现，PBS和Ad LacZ组小鼠肿瘤生长迅速，Ad LIGHT组小鼠肿瘤生长缓慢，并于第14天肿瘤开始逐渐减小，且有71.43％的肿瘤最终消退并得到了长期存活(＞90天)。在90天的观察期内，PBS和Ad LacZ组小鼠在40天左右全部死亡，而Ad LIGHT组小鼠的生存率为71.43％，显著延长了小鼠的生存期。接着，我们检测了小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性，研究发现，Ad LIGHT治疗组增强了小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性，明显高于对照组，提示机体被诱导产生了特异性和非特异性的抗肿瘤免疫反应。对治疗后的各组小鼠的肿瘤组织做了病理切片，结果显示，伴随着瘤内炎性细胞(中性粒细胞，淋巴细胞)中等程度的浸润，Ad LIGHT组较Ad LacZ组和PBS组有更多的炎性细胞，且观测到部分肿瘤组织发生坏死。炎性细胞对肿瘤的浸润和肿瘤组织的坏死有利于机体对肿瘤的清除。我们还用半定量PCR检测了肿瘤组织中趋化因子CCL21、IP-10、Mig的表达情况。结果发现，在Ad LIGHT组三者均有表达，Ad LacZ组IP-10、Mig也有少量的表达，说明腺病毒介导的LIGHT可以诱导趋化因子的产生，从而发挥趋化T淋巴细胞和抑制肿瘤血管形成的作用。最后我们检测了Ad LIGHT治疗是否诱导了小鼠长远性的保护性免疫力，我们将Ad LIGHT治疗组长期存活的小鼠，在左腹皮下接种A20细胞，同时以未经任何处理的小鼠作为对照组，皮下接种同数量的A20细胞，观察每组小鼠成瘤比率和存活时间。结果发现，Ad LIGHT治疗诱发小鼠产生了针对A20细胞的特异性保护免疫。结论：1．腺病毒介导的LIGHT能在A20细胞中有效表达，诱导了A20细胞表面共刺激分子ICAM-1以及分子Fas的表达增加，可有效刺激T淋巴细胞增殖并诱导IFN-γ的分泌；同时LIGHT还可诱导部分A20细胞发生凋亡。2．Ad LIGHT修饰的A20细胞作为瘤苗免疫小鼠，可诱导机体产生对A20淋巴瘤细胞攻击的免疫保护作用，增强小鼠脾细胞的NK细胞和CTL细胞的杀伤活性，部分小鼠在肿瘤攻击后可长期存活。3．瘤内注射Ad LIGHT治疗小鼠B淋巴瘤，可有效抑制肿瘤生长并促进其消退，部分小鼠得到了长期存活。Ad LIGHT治疗增强了小鼠脾细胞的NK和CTL杀伤活性，诱导机体产生了特异性和非特异性的抗肿瘤免疫反应。Ad LIGHT治疗后存活的小鼠还产生了针对A20淋巴瘤的长远性特异性保护免疫。4．Ad LIGHT治疗能诱导肿瘤组织趋化因子CCL21、IP-10和Mig的表达，LIGHT治疗组小鼠肿瘤组织内有较多的炎性细胞浸润和坏死。上述结果说明用Ad LIGHT修饰A20细胞做为肿瘤疫苗免疫小鼠对肿瘤的再次攻击有一定的预防作用。用Ad LIGHT对B细胞淋巴瘤小鼠进行瘤内注射有较显著的抗肿瘤效果，显示了LIGHT基因疗法可能在恶性B细胞淋巴瘤的基因治疗方面具有潜在的应用价值，可为开辟恶性B细胞淋巴瘤治疗的新方法和新途径提供思路。