背景：　　 高血压是多种心血管疾病的主要危险因素之一。高血压时血流动力学的改变使心脏靶器官受损,最终导致心力衰竭的发生。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS),尤其是血管紧张素Ⅱ的激活导致血压升高和炎症反应,进而引起心脏组织的重构,过多的细胞外基质沉积造成心脏组织纤维化和靶器官损害。然而,压力超负荷引起的心脏损伤的病理生理及分子生物学机制尚未完全阐明。　　 迄今为止,对导致心脏纤维化的细胞和分子机制知之甚少。普遍认为,肌成纤维细胞是最重要的胶原生成细胞,其活化在心脏细胞外基质的重塑中发挥重要作用,是构成胶原沉积的先决条件。研究表明,包括血管紧张素、醛固酮、转化生长因子-β1、拉伸及糖尿病等因素均可以促进肌成纤维细胞的活化,这些不同刺激因素能使成纤维细胞活化为肌成纤维细胞并分泌大量胶原,使细胞外基质沉积,继而促进心肌纤维化的发生发展。巨噬细胞作为一种炎症细胞,在心脏炎症性损伤和纤维化中发挥重要作用。各种应激刺激可导致循环中的单核细胞穿过血管壁,浸润到心脏受损伤部位,继而分化为巨噬细胞并产生分泌炎症细胞因子,包括肿瘤坏死因子-α,白细胞介素-1β及转化生长因子-β1和其它炎性介质。这些细胞因子对肌成纤维细胞的活化发挥了的至关重要的作用。　　 在压力负荷导致的心脏重塑过程中,自噬和溶酶体途径的激活发挥重要的调节作用,成为高血压领域研究的热点。自噬作为决定细胞存活与死亡的因素参与心脏压力超负荷导致心脏衰竭的病理生理过程。在压力负荷引起的心脏衰竭模型中发现心肌细胞自噬的增加。最近的研究表明,压力超负荷会触发心肌细胞自噬,参与心脏衰竭的发病机制,适当的自噬在应激状态下可能发挥积极的适应性保护作用。自噬起始于胞浆内出现双层或多层膜状的结构,将胞浆成分如多余的蛋白质,细胞器及线粒体等完全包绕形成自噬小体,自噬小体与溶酶体融合形成自噬溶酶体并由溶酶体中的蛋白水解酶降解。自噬对于维持细胞的稳态十分重要。组织蛋白酶(Cathepsin,Cat)家族是一类定位于溶酶体的蛋白水解酶,目前认为,其主要作用为降解血管壁的弹力蛋白,并参与动脉粥样硬化及动脉瘤的发生发展。最新证据表明,组织蛋白酶CatD-/-或CatB-/-CatL-/-双基因敲除小鼠大脑神经细胞中,发现大量异常自噬小体的堆积,提示组织蛋白酶对细胞自噬具有调节作用。CatS是一种在酸性和中性环境中均能发挥作用的组织蛋白酶家族成员,主要表达于巨噬细胞、平滑肌细胞及内皮细胞。然而,目前还不清楚在高血压导致的纤维化损伤中,细胞自噬的作用及机制。组织蛋白酶CatS及自噬在AngⅡ诱导的心脏炎症及纤维化的中的作用及机制也有待研究。　　 我们假设:血管紧张Ⅱ通过刺激巨噬细胞CatS的表达,降解细胞内自噬小体,对于巨噬细胞的代谢和功能起保护作用。CatS基因的缺陷将导致自噬过程的异常,自噬小体堆积、线粒体自噬不能及时被清除、ROS产生增加,同时胞浆内多余蛋白降解障碍,氨基酸产生减少,细胞坏死增加。上述过程导致NF-κB被激活,触发心脏炎症反应及纤维化。本研究以CatS基因缺陷小鼠作为研究对象,关注于血管紧张Ⅱ触发心脏炎症反应的早期阶段,探讨细胞自噬障碍导致炎症细胞活化这一核心环节,为探明高血压性心脏病导致心脏纤维化的发病机理提供实验和理论依据,为临床上心衰的早期干预和治疗提供新的靶点。　　 目的：　　 通过制备血管紧张素Ⅱ灌注导致小鼠高血压模型,模拟在体情况下压力超负荷。采用病理学及分子生物学等技术检测心脏组织炎症细胞浸润、炎症因子表达及胶原沉积;检测巨噬细胞自噬的产生,线粒体自噬相关ROS产生及NF-κB的激活;观察细胞超微结构的改变,明确血管紧张素Ⅱ导致心脏纤维化过程中溶酶体组织蛋白酶S对巨噬细胞自噬及炎症反应的调控作用。通过给予饥饿或血管紧张素Ⅱ刺激巨噬细胞,探讨饥饿及血管紧张素Ⅱ引发细胞自噬及自噬性细胞坏死的机制。探讨组织蛋白酶S对体内、外巨噬细胞自噬功能的影响及相关信号途径,为寻找有效的临床干预措施提供理论和实验依据。　　 方法：　　 1.研究对象分组:　　 第一部分实验,实验动物雄性组织蛋白酶S基因敲除小鼠(C57/BL6背景)16只,野生C57/BL6雄性小鼠16只。均随机分为2组(n=8):醋酸生理盐水溶液灌注组(Vehicle,假处理组);血管紧张素Ⅱ灌注组(处理组)。　　 第二部分实验,组织蛋白酶S基因敲除小鼠和野生C57/BL6雄性小鼠各8只,提取骨髓来源巨噬细胞。　　 2.小鼠高血压模型制备:采用血管紧张素Ⅱ微量泵(750ng/kg.min)持续灌注7天模拟高血压致心脏纤维化。　　 3.血压测量:采用尾套管血压仪连续测定实验小鼠尾动脉血压。　　 4.心脏功能测定:采用小动物超声心动仪测定小鼠心脏功能。　　 5.心脏组织纤维化测定:采甩Masson三色特殊染色方法检测组织内胶原沉积。　　 6.心脏组织炎症细胞因子表达:免疫组织化学染色方法检测:Mac-2,CollagenⅠ,α-SMA,IL-1,TNF-α及TGF-β的蛋白表达;RT-PCR方法检测炎症因子IL-1β、TNF-α及TGF-β的mRNA表达。　　 7.免疫荧光共定位检测:激光共聚焦显微镜观察F4/80与组织蛋白酶S共定位,F4/80与LC3共定位,MitoTraker与LC3共定位。　　 8.巨噬细胞超微结构:透射电镜观巨噬细胞自噬超微结构。　　 9.WesternBlot蛋白免疫印记法检测:组织L,C3Ⅰ/Ⅱ表达及定量,Raptor磷酸化水平及定量。　　 10.细胞培养及处理:小鼠腹腔巨噬细胞分离培养及骨髓来源巨噬细胞分离培养,分别给予血管紧张素Ⅱ或饥饿诱导。RawCell264.7单核细胞系。　　 11.报告基因NF-κB激活:巨噬细胞转染NF-κB腺病毒(Ad.NF-κB-Luc)24小时,加入荧光素底物,用经诺真活体成像系统采集检测NF-κB的活性。　　 12.氨基酸含量检测:采用液质联用质检谱检测细胞上清中氨基酸水平。　　 13.ROS产生:MitoTracker与ROS共定位检测线粒体产生ROS。MitoSOX直接标记线粒体特异性ROS的产生。流式细胞仪定量检测MitoSOX阳性细胞百分比。　　 14.统计学分析:所有数据都以平均值士标准差表示。组间均数比较采用one-wayANOVA;P＜0.05认为差异有统计学意义。　　 结果：　　 1.血管紧张素Ⅱ灌注野生小鼠血压显著高于生理盐水灌注组,心脏组织表达CatS增加。　　 2.CatS基因敲除加重血管紧张素Ⅱ诱导的collagenⅠ、α-SMA和TGF-β1的表达,使心脏纤维化加重。　　 3.CatS基因敲除加重血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞浸润,使IL-1β、TNF-α和TGF-1β的蛋白表达及mRNA表达水平均显著升高。　　 4.CatS基因敲除加重血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞线粒体ROS产生和NF-κB激活。　　 5.CatS基因敲除导致血管紧张素Ⅱ诱导的巨噬细胞自噬小体堆积。　　 6.CatS缺陷导致饥饿诱导的骨髓来源巨噬细胞自噬小体堆积。　　 7.Cats缺陷导致饥饿诱导的体外培养巨噬细胞上清中氨基酸产生减少。　　 8.CatS缺陷导致饥饿诱导巨噬细胞空泡化、Raptor磷酸化和NF-κB激活。　　 9.CatS缺陷加重饥饿和血管紧张素Ⅱ诱导的细胞坏死。　　 结论：　　 1.CatS基因敲除加重血管紧张素Ⅱ诱导的心脏巨噬细胞自噬增加,促进心脏炎症反应和纤维化。　　 2.CatS基因敲除加重血管紧张素Ⅱ诱导巨噬细胞线粒体自噬异常,ROS清楚障碍,激活NF-κB,促进炎症反应。　　 3.CatS缺乏使饥饿诱导的巨噬细胞自噬小体堆积,氨基酸的再循环障碍,抑制Raptor的磷酸化,导致自噬性细胞坏死。　　 4.CatS缺乏促进饥饿和高血压/血管紧张素Ⅱ诱导的细胞坏死,产生细胞碎片,导致NF-κB激活并促进炎症反应。　　 综上所述,本研究结果表明,血管紧张素Ⅱ导致血压升高和巨噬细胞释放炎症细胞因子,CatS通过抑制自噬小体堆积导致的炎症和重构,对心肌纤维化起保护作用。本研究首次证明巨噬细胞CatS的缺陷导致线粒体自噬清除障碍、ROS产生增加和NF-κB激活,促进炎症细胞因子的分泌,最终导致心脏炎症和纤维化。同时还证实,CatS参与了自噬相关细胞死亡的调控,为今后的自噬性细胞坏死的研究提供了新的实验依据,为临床上控制和抑制压力负荷下心脏炎症和纤维化提供了崭新的视角。本研究提供新颖的体内和体外的证据,表明溶酶体酶CatS的激活可能在压力超负荷导致的心脏损伤中发挥有益的保护作用。