阿尔茨海默氏病(Alzheimer’s disease,AD)是一种神经退行性疾病,其高发人群主要是中老年人,预计到2050年全世界有超过1.315亿的痴呆症患者。AD最重要的病理特征是老年斑和神经纤维缠结(NFTs),前者是Aβ肽的细胞外聚集体,后者是细胞内超磷酸化微管相关蛋白Tau蛋白的聚集体。AD病因及发病机制至今尚有争论,近些年各种假说中最有影响力的是淀粉样蛋白级联假说。该假说认为AD的起始事件是淀粉样前体蛋白在被分泌酶切割降解过程中产生多的Aβ42,接着引起一系列病理学变化,进而导致AD的发生。该理论最初认为神经元功能障碍和死亡是由总Aβ的含量的神经毒性作用导致的,最近有人提出,不仅Aβ肽单体导致神经元功能障碍,Aβ肽的低聚形式(2至12个肽的小聚集体)实际上比Aβ高聚形式(例如老年斑)对脑功能有更大的损害。本课题组在前期研究中获得了两种抗Aβ42低聚体的单链抗体MO6和HT7,分析结果表明,单链抗体MO6和HT7均能特异性识别Aβ42的寡聚体和原纤维形态,且能够抑制Aβ42的进一步聚集和促进Aβ42聚集体的解聚,对Aβ42产生的神经毒性有明显的抑制作用,但是MO6和HT7对Aβ42的作用效果却有些不同,如HT7对Aβ42聚集体的结合力更强。由于MO6和HT7重链结构域(VH)非常相似,而轻链结构域(VL)存在较大差异,推测这可能是导致二者功能上差异的原因。为了进一步确定单链抗体HT7的VH、VL结构域与Aβ42的相互作用的特性及其差异机制,在本论文中,我们系统分析并提出了单链抗体HT7的VH、VL结构域在识别、结合Aβ42寡聚体及抑制其聚集和细胞毒性等方面的性质与功能机制,以及对全抗体HT7作用的贡献,获得如下结果:(1)利用分子克隆手段,构建了单链抗体HT7的VH、VL重组表达载体pET28a-scFv-VL和pET28a-scFv-VH,获得了单链抗体HT7的VH、VL的表达工程菌,并诱导制备了较高纯度的VH和VL蛋白。(2)分析并确定了单链抗体HT7的VH、VL结构域与单链抗体HT7相似,均对Aβ42的低聚形式(寡聚体和原纤维)具有较强的特异性,但三者对于Aβ42的纤维形式几乎都不识别。(3)通过测定抗原抗体的平衡解离常数(),VH或VL结构域与Aβ42寡聚体的表观亲和性高于VH&VL的表观亲和性,而后者又高于完整的单链抗体HT7的亲和性。(4)单链抗体HT7的VL结构域倾向于与低分子量的Aβ42聚集体发生相互作用,而VH结构域倾向于与Aβ42的寡聚体与原纤维发生较强的相互作用,并抑制它们的进一步聚集。(5)单链抗体HT7的VH、VL结构域与单链抗体HT7相似,对Aβ42的细胞毒性的均有抑制作用,并表现出浓度相关性,其中VH&VL抑制效果最强。由此可见,上述(2)至(5)的结果是一致的,均表明,单链抗体HT7中VH结构域,虽然对Aβ42寡聚体的亲和性较高,但其具有较明显的自聚集的倾向,而VL结构域虽然对Aβ42寡聚体的亲和性略低,但其自聚集的倾向较低。因此VL与VH的混合体系对Aβ的细胞毒性的抑制效果更明显,而且这种抑制效果高于单链抗体HT7,这也表明,单链抗体HT7中linker对于VH和VL结构域的功能有一定的制约性,但linker的存在,提高了VH与VL的复合效应,因此单链抗体HT7的有效浓度低于VH&VL。本论文的研究结果,为进一步在分子水平上改造抗Aβ42的单链抗体奠定了基础,同时也为研发更有效的抗细胞毒Aβ42、并促进Aβ42的代谢的单链抗体提供了一定的理论指导,为AD的诊断和治疗奠定理论和实践基础。