羊水栓塞是羊水进入母体血液循环后引起的极严重的分娩期并发症,其有关发生率的文献报道并不一致,为1：5000-1：80000。足月妊娠时死亡率高达70-80%,其诊断主要依据多样复杂的临床表现。目前对羊水栓塞等多种妊娠相关疾病的早期检测仍缺少公认的标准,而且现在使用的标记物有不充分的个体检测率和特异性,因此需要开发多种生物标记,进一步寻找更为特异性的标记物。对于来源于不同组织或者不同生理状态下的蛋白质样品间的比较,是用于鉴定某种疾病的生物标记的可能性之一。目前蛋白组学分析已被广泛用于体液的研究中,许多研究组采用不同的技术方法,使用不同的蛋白质数据库,而且鉴定蛋白质的严密水平也是不同的,对此我们很难去评价每个蛋白质数据库的准确性,但采用不同技术路线所获得的结果是可以互相印证和补充的。实验目的：通过载体两性电解质2-DE和MALDI-TOF质谱等蛋白质组学技术对正常人羊水和血浆进行比较,希望在羊水中发现一些特异表达的蛋白质标记物,从而能早期诊断羊水栓塞等妊娠相关疾病。可以说,羊水中某些蛋白质的表达是很有意义的,它们反映了妊娠期生理上和病理上的状况,因此羊水的蛋白质组学分析对阐明妊娠期机体病理变化来说,是理想的第一步,这也将有助于我们发现某些妊娠疾病的早期诊断性标志物。实验方法：1.样品的制备：羊膜腔穿刺法采集12份正常妊娠(16-18周)孕妇的羊水以及肘部静脉穿刺采集12份正常人血浆,然后离心取上清,冷冻干燥以利于保存。2.样品的处理：本研究所采用的是基于Cibacron blueF3GA填料的亲和层析吸附白蛋白的方法,以去除体液中的第一大高丰度蛋白,即白蛋白。3.2-DE：采用载体两性电解质pH梯度等电聚焦为第一向的双向电泳(ISO-2DE)和与质谱兼容的银染技术,观察正常人羊水和血浆样品两者间的蛋白表达情况。4.凝胶图像的分析：载体两性电解质的等电聚焦双向电泳凝胶,通过Canon 5.0数码相机获取图像,再利用PDQquest 8.0软件分析完成差异分析。在羊水组和血浆组之间进行斑点检测和匹配,从而在羊水组中找到差异性蛋白点。5.银染胶内酶解肽段的提取：扣取特异性蛋白点,然后进行酶解并提取肽段。6.肽指纹图谱分析：根据提取的肽段,通过moverz、peakErazor和mascot软件来搜索并鉴定可能的相应蛋白。7.确定差异蛋白质：通过Western Blotting技术,再次验证羊水中的差异性蛋白是否只存在于羊水中,而并不存在于血浆中。实验结果：1.本实验采用的是基于Cibacron blue填料亲和层析吸附白蛋白的方法,SDS-PAGE的结果可见羊水和血浆中的大部分白蛋白(Mw 66ku)已被去除,蛋白条带较去除前明显清晰。2.应用载体两性电解质2-DE分离羊水和血浆中的蛋白质,其结果显示,羊水约102个蛋白点,血浆约147个蛋白点。3.利用PDQquest 8.0软件完成差异分析,其中在羊水中发现4个差异蛋白点。4.使用moverz、peakErazor和mascot软件来搜索,肽指纹图谱分析结果是,羊水中四个差异蛋白点,分别是ZAP-70、T-Box 3、IKK-β和KIAA 1145。5.为确定这些差异蛋白,我们通过考马斯亮蓝定量和Western-Blotting方法来验证。本实验只对IKK-β和T-Box 3蛋白进行分析,结果发现在血浆中也均存在这两种蛋白质,其中血浆中IKK-β含量并不低,与羊水中含量并无明显差异,而羊水中T-Box 3蛋白的含量是高于血浆的,这个差异有一定的意义。结论：本实验室先通过Cibacron blue F3GA去除血浆和羊水中的白蛋白后,再应用载体两性电解质2-DE、PDQUEST软件分析和MALDI-TOF等技术对正常人羊水和血浆进行蛋白组学分析和比较,在羊水中找到了特异表达的蛋白质标记物,这对发现羊水栓塞等妊娠相关疾病的早期诊断标志物提供了研究基础,同时采用的技术路线所获得的结果对其他技术路线所获结果可能也是一个补充。未来研究方向：通过Western-Blotting技术,继续验证血浆和羊水中的差异蛋白质。差异蛋白经过确认后,我们可以克隆和表达基因,制备抗体,并用ELISA来检测抗体的效价。