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[研究背景及目的]二甲双胍是目前临床应用最为广泛的口服降糖药物,主要用于治疗2型糖尿病。近年来一些临床流行病学研究证实二甲双胍可以降低2型糖尿病患者一些恶性肿瘤的发病风险,多项体外研究和动物实验发现二甲双胍对多种类型的癌细胞均具有一定程度的抑制作用,并可抑制裸鼠移植瘤模型中肿瘤的生长。但是二甲双胍抑制肿瘤的确切机制至今仍不清楚。本研究主要探讨二甲双胍对乳腺癌细胞Shh信号通路的调控作用,阐明二甲双胍通过Shh信号通路对乳腺癌增殖、迁移、侵袭能力及乳腺癌干细胞(BCSCs)干性的影响；并进一步探讨腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)在其中的调控作用。[方法]逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和western blot检测二甲双胍对乳腺癌MDA-MB-231、MCF-7和BT549细胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1表达的影响；将MDA-MB-231细胞分为空白对照组、1μg/mL rhShh蛋白组、3mM二甲双胍组和1μg/mL rhShh蛋白+3mM二甲双胍组,用细胞增殖实验、克隆形成实验检测对乳腺癌细胞增殖能力的影响；划痕实验、matrigel侵袭实验检测对乳腺癌细胞迁移和侵袭能力的影响；流式细胞术、mammosphere形成实验检测对BCSCs干性的改变；将表达绿色荧光蛋白(GFP)的MDA-MB-231细胞接种于BALB/c-nu鼠的乳腺脂肪垫部位,分别给予瘤内注射rhShh蛋白、二甲双胍灌胃、瘤内注射rhShh蛋白+二甲双胍灌胃的处理,使用活体成像系统(IVST)检测肿瘤体积的大小,比较不同处理组之间肿瘤的生长情况；MDA-MB-231细胞分别转染空白对照质粒(siCtr)和AMPK小干扰RNA质粒(siAMPK#2)后,再分别给予rhShh蛋白、二甲双胍、rhShh蛋白十二甲双胍的处理,用western blot检测细胞中Gli1的表达情况,用mammosphere形成实验和流式细胞术检测对BCSCs的影响。[结果]1.二甲双胍抑制乳腺癌细胞中Shh、Smo、Ptc和Gli1的表达,且呈现时间依赖性和浓度依赖性。2.二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的乳腺癌MDA-MB-231和MCF-7细胞的增殖。用MTT实验和克隆形成实验检测rhShh蛋白、二甲双胍以及rhShh蛋白和二甲双胍的联合处理对乳腺癌MCF-7和MDA-MB-231细胞增殖能力的影响。MTT实验显示rhShh蛋白促进细胞增殖；二甲双胍显著抑制细胞的生长,同时二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的细胞增殖(**或##P<0.01)。克隆形成实验结果显示同空白对照组相比,二甲双胍抑制乳腺癌细胞形成的克隆的数目和大小,此外,二甲双胍也抑制了rhShh蛋白诱导的克隆的数目和大小(**或##<0.01)。3.裸鼠移植瘤模型中二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的肿瘤生长。分析荧光数据表明rhShh蛋白处理组的肿瘤体积显著大于空白对照组肿瘤的体积；二甲双胍抑制了rhShh蛋白诱导的肿瘤生长(**或##<0.01)。免疫组化实验结果显示rhShh蛋白组的Gli1表达水平较高,联合处理组的Gli1水平比rhShh蛋白组的低。4.二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的乳腺癌MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。划痕实验显示rhShh蛋白处理组的MDA-MB-231细胞迁移能力增强；与之相反的是,二甲双胍抑制MDA-MB-231细胞的迁移能力；联合处理组显示二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的MDA-MB-231细胞的迁移能力(**或#粕<0.01)。Matrigel侵袭实验显示rhShh蛋白处理的细胞穿过matrigel胶和小室膜的数量约是空白对照组的三倍；同rhShh蛋白处理组相比,rhShh蛋白联合二甲双胍的处理显著抑制了细胞的侵袭能力(**或##JP<0.01)。5.二甲双胍抑制rhShh蛋白诱导的BCSCs干性增强。Mammosphere形成实验表明同空白对照组相比,rhShh蛋白作用的MDA-MB-231细胞形成的球体数目更多、体积更大；而二甲双胍抑制了MDA-MB-231细胞形成的球体的数目和体积,也抑制了rhShh蛋白诱导形成数目更多和体积更大的球体(**或##<0.01)。使用流式细胞术检测乳腺癌细胞中CD44+/CD24-/low细胞的比例,rhShh蛋白诱导MDA-MB-231细胞中CD44+/CD24-/low细胞的比例提高；二甲双胍的作用降低细胞中的CD44+/CD24-/low细胞比例；联合处理组显示二甲双胍显著抑制了由rhShh蛋白诱导的CD44+/CD24-/low细胞比例的提高(**或##<0.01)。6. Western blot显示同空白对照及转染阴性对照siRNA后,又进行rhShh蛋白和二甲双胍联合处理的MDA-MB-231细胞中Gli1的表达水平相比,转染AMPKαl siRNA#2后又进行rhShh蛋白和二甲双胍联合处理的MDA-MB-231细胞中Gli1的表达水平明显升高。7.在rhShh蛋白和二甲双胍联合处理的情况下,同空白对照及转染阴性对照siRNA的MDA-MB-231细胞形成的微球体相比,转染AMPKal siRNA#2的MDA-MB-231细胞产生的微球体数目更多、体积更大(&&P<0.01),而且其中的CD44+/CD24-/low干细胞的比例显著升高(&&P<0.01)。[结论]本实验结果表明二甲双胍通过抑制乳腺癌细胞中的Shh信号通路发挥抗癌作用。二甲双胍导致的Shh信号通路的下调抑制了体外实验中的乳腺癌细胞的增殖、减弱了细胞的迁移和侵袭能力、降低了乳腺癌干细胞的比例和自我更新能力,并且抑制了裸鼠移植瘤模型中肿瘤的生长。二甲双胍对Shh信号通路的抑制是依赖AMPK调控的。