论文部分内容阅读
原发性肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，且其恶性程度高。化疗是肝癌重要的治疗手段，但肝癌细胞对化疗药物敏感性差，容易产生多药耐药（multidrug resistance,MDR）。在肝癌的发生机制中，乙肝病毒（HBV）感染是肝癌的发生的重要因素。整合于宿主细胞的乙型病毒肝炎HBX基因作为重要的功能基因，是影响肝癌生物学特征的重要影响因素。既往有研究表明HBX参与介导了肝癌的多药耐药。同时在研究中我们也发现凋亡并非是肝癌细胞死亡的唯一方式，对凋亡水平的调控也并不能完全干预肝癌细胞的MDR。因此，我们需从非凋亡的角度进一步探索HBX诱发肝癌细胞耐药的一些新的可能机制，以期全面地多方面诠释肝癌发生MDR的分子机制。自噬（autophagy）作为真核细胞所特有生命现象，已被证明其参与了肿瘤细胞对化疗药物的耐受调控。肿瘤细胞可通过自噬保护性地排除受损蛋白或细胞器，隔离有害物质，加快大分子物质循环，导致肿瘤细胞表达耐药表型。机体通过这种特殊的方式来保持内环境的稳定。细胞内存在感知外周环境变化的信号通路，Gα干扰蛋白（Gα-interactingprotein, GAIP）作为重要的自噬调节上游蛋白，参与了肿瘤细胞的自噬水平改变的调节。因此，我们需进一步探究HBX蛋白是否介导Gα干扰蛋白的表达而改变了细胞的自噬水平，进而影响了肿瘤细胞多药耐药表型的变化。我们将从HBX介导自噬角度去深入地加以研究及探讨。第一部分：HBX蛋白转染后肝癌细胞对化疗药物的抵抗目的：探究HBX蛋白对肝癌细胞多药耐药所产生影响，并对多药耐药蛋白表达起到调节作用。方法：培养及鉴定稳定表达HBX蛋白的HepG2人肝癌细胞系及普通HepG2人肝癌细胞系。MTT法观察HBX蛋白转染后肝癌细胞系对化疗药物的抵抗。Westernblotting方法检测多药耐药蛋白p170的表达。结果：鉴定及培育了稳定表达HBX蛋白的HepG2人肝癌细胞系。稳定转染HBX蛋白的HepG2细胞对盐酸多柔比星及顺铂化疗敏感性低，存在明显耐药性，且多药耐药蛋白p170（MDR-1表达的跨膜糖蛋白）的表达明显高于对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：HBX蛋白的稳定表达对HepG2细胞的生物学行为产生了影响。稳转HBX蛋白的HepG2细胞对多种化疗药物的敏感性较普通HepG2细胞降低。增强化疗药物外排作用的多药耐药蛋白p170的表达上调，提示HBX蛋白参与调控了该蛋白表达，实验组细胞出现耐药性增强的现象。第二部分：HBX蛋白对肝癌细胞自噬水平的调节作用目的：探究HBX蛋白对肝癌细胞自噬水平的调节作用。方法：Western blotting方法检测HBX蛋白对自噬蛋白Becline1、LC3-Ⅱ表达的调节作用。结果：稳定转染HBX蛋白的HepG2细胞较对照组肝癌细胞内自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ表达升高，差异有显著性（P<0.01），提示HBX蛋白上调了HepG2细胞的自噬水平。结论：HBX蛋白对肝癌细胞的自噬水平产生了调节作用。稳定转染HBX蛋白的HepG2细胞较普通HepG2细胞的自噬蛋白Beclin1和LC3-Ⅱ的表达量均增高，表明其自噬水平上调。第三部分：改变自噬水平影响肝癌细胞对化疗药物的敏感性目的：改变肝癌细胞的自噬水平后观察细胞对化疗药物敏感性变化及其对多药耐药蛋白p170表达的影响。方法：上调自噬水平的雷帕霉素及下调自噬水平的3-MA、溶酶体抑制剂E64作用于二组肝癌细胞系后，Western blotting方法及MTT法检测不同自噬水平对肝癌细胞化疗敏感性的影响。结果：自噬水平的上调使HepG2细胞对化疗药物的敏感性下降，多药耐药蛋白p170表达上调（P<0.05），耐药性增强；而E-64、3-MA对肝癌细胞自噬水平的抑制提高了HepG2细胞的化疗敏感性，多药耐药蛋白p170表达下调（P<0.01），耐药性降低。结论：自噬水平改变调节了肝癌细胞的化疗敏感性，证明了HBX蛋白介导自噬参与了多药耐药。第四部分：GAIP在HBX蛋白诱导肝癌细胞自噬中的作用目的：探究HBX蛋白对肝癌细胞自噬上游Gα干扰蛋白的调节作用。方法：荧光定量PCR方法、Western blotting方法检测GAIP在HBX蛋白诱导肝癌细胞自噬中的表达情况。结果：在稳定转染HBX蛋白的HepG2细胞中，自噬调节蛋白GAIP在mRNA和蛋白水平表达均显著增高，提示HBX蛋白可上调自噬调节蛋白GAIP的表达，较对照组差异性显著（P<0.01）；结论：HBX蛋白可上调肝癌细胞内自噬蛋白GAIP的表达。