背景:支气管哮喘是一种慢性的呼吸道炎性免疫疾病,临床表现为反复发作性喘息、胸闷和咳嗽症状。哮喘是一种严重的全球性健康问题,影响所有年龄段,给社会和家庭带来沉重的经济负担。哮喘已成为近几十年来最流行的儿童疾病,全世界约有十分之一的儿童受到哮喘的影响,是导致儿童急诊室就诊和上学缺勤的主要原因。据报道,发达国家报告的哮喘患病率高于发展中国家。哮喘患病率的迅速提高以及明显的地理差异表明,除了种群遗传之外,环境可能在哮喘的病因学中扮演了重要角色。近年来,大量对于哮喘发病率增高的相关因素研究发现:生命早期长时间接触农畜或宠物、稻草、生活环境中富含微生物群和饮用新鲜牛奶,对预防儿童哮喘等过敏性疾病的发生具有重要作用。更有研究者将这种微生物暴露对哮喘的保护机制推溯到胚胎期,甚至更早。生命早期的微生物组对人类长期健康具有重大影响,越来越多的证据支持母体和子宫内微生物组在儿童健康和发育中的重要作用。在产前的这个关键时期,发育中的免疫系统可能在胎儿和新生儿生命阶段就产生了免疫耐受的能力。产前这个关键时间点的环境影响可以改变生命早期的过敏性疾病及哮喘的易感性。虽然生命早期的富含微生物环境对儿童哮喘的预防保护作用在人体队列研究中已经被广泛证实,而且有望成为降低哮喘发病率的可行方法,但尚缺乏在动物实验中进行深入的分子免疫机制研究和安全性研究。有学者应用低剂量LPS(内毒素)、农村环境常见细菌提取物S.sciuri W620、lwoffii F78等作为刺激原模拟高微生物负荷环境来研究对小鼠哮喘的影响。但由于LPS浓度较难控制,且需要排除肺损伤的干扰,在安全性和稳定性方面存在一定缺陷。而单一的细菌提取物难以模拟实际环境中的多种混合细菌。所以需要寻找一种安全、常见的多种细菌提取物来模拟高微生物负荷刺激母鼠是关键,所产子代小鼠(子鼠)再制作过敏性气道疾病(AAD)模型(人类哮喘的动物模型)。目的:建立一种安全稳定的“高微生物负荷母鼠-子鼠过敏性气道疾病(AAD)模型”,然后在此动物模型中进行深入的分子免疫机制研究,为哮喘的早期预防奠定理论基础。方法:1、高微生物负荷的母鼠实验条件的筛选。实验中把未孕雌鼠分为5个组,分别给予PBS、思连康(双歧杆菌四联活菌片,100mg/kg)、及3个不同浓度水平(1mg/kg、0.1mg/kg、0.01mg/kg)的泛福舒(细菌溶解产物)灌胃30天。隔天称体重,安乐死前收集粪便。选择肠道微生物群丰度增高、肠道TLR(Toll样受体)2和TLR4表达高、脾脏Treg(调节性T细胞)比例高、对未孕雌鼠体重无影响的组别做为高微生物负荷的母鼠实验条件,进行下一步子鼠的繁殖。2、子鼠AAD模型的制作。用1中筛选出的母鼠实验条件从雌雄鼠合笼前10天开始给母鼠灌胃直至分娩,繁殖的子代统计性别比例及新生小鼠死亡率。子鼠第21天断奶,在第25天即开始用OVA(鸡卵清白蛋白)制作AAD模型。检测子鼠AAD模型特征:肺部病理及炎症评分、支气管肺泡灌洗液(BALF)中OVA特异性Ig E浓度、细胞总数、嗜酸性粒细胞分类及血浆中Th2相关细胞因子IL-13的浓度。3、按筛选出的1mg/kg泛福舒的母鼠刺激条件重复制作高微生物负荷的母鼠-子鼠AAD模型,收集母鼠产前粪便进行肠道微生物群的16S r RNA基因检测。收集刚刚分娩母鼠的肠道组织、脾脏组织及外周血,检测其结肠粘膜下淋巴组织中TLR2和TLR4表达、结肠HDAC9表达及脾脏Treg比例和血浆IL-10浓度。子鼠进行哮喘模型制作之后,检测其肺部TLR2及TLR4的表达、Treg调节相关的HDAC9和Foxp3的表达;脾脏、外周血中Treg的比例以及血浆中IL-10浓度;血浆及BALF中Th1、Th2相关细胞因子的浓度和相关基因的表达;血浆及BALF中Th9和Th17相关细胞因子的表达。结果:1、与对照组未孕雌鼠相比,泛福舒(1mg/kg)组未孕雌鼠显示出以下优势:体重曲线无变化;粪便的16S r RNA基因测序检测结果中肠道群落丰富度显著提高(chao指数P<0.05)、群落聚类也比其他实验组明显;结肠TLR2表达(免疫组化p=0.002,rt-PCR p=0.003)及TLR4表达(免疫组化p=0.002,rt-PCR p=0.002)高;脾脏中Treg(CD4~+CD25~+Foxp3~+细胞)比例高(p=0.028)及血浆中IL-10浓度高(p=0.002)。因此泛福舒(1mg/kg)组作为高微生物负荷的母鼠实验条件,进行下一步子鼠的繁殖。2、在子鼠的AAD模型中,对照组母鼠和高微生物负荷母鼠繁殖的子鼠体重增加曲线、死亡率(p=0.113)与性别比(p=0.774)无差别。与对照组母鼠相比,高微生物负荷组母鼠所产子鼠的AAD病理特征减轻(病理评分p=0.033)、BALF中OVA-Ig E浓度(p=0.023)、细胞总数(p<0.001)及嗜酸性粒细胞计数(p<0.001)降低。但BALF中IL-13未表现出差异(p=0.087)。高微生物负荷的母鼠-子鼠AAD模型制作成功。3、与对照组母鼠相比,母鼠在妊娠期间接受高微生物负荷刺激后,肠道微生物群落的丰富度增加(ace指数p=0.0075)及聚类明显;结肠粘膜下淋巴组织中TLR2(粘膜免疫组化p=0.004,粘膜下淋巴组织免疫组化p=0.041)及TLR4(粘膜免疫组化p=0.005,粘膜下淋巴组织免疫组化p=0.041)表达升高;结肠中HDAC9表达降低(p=0.029),脾脏中Treg的比例增高(p=0.006),血浆IL-10浓度升高(p=0.012)。在子鼠的AAD模型中,与对照组母鼠所产的子鼠相比,高微生物负荷组母鼠所产子鼠肺部TLR2(免疫组化p=0.015,rt PCR p=0.035)及TLR4(免疫组化p=0.027,rt PCR p=0.022)和HDAC9的表达(rt PCR p=0.032)与其母亲出现了一致的变化;Foxp3表达升高(p=0.013)、Treg比例增加(p=0.040);Th2相关细胞因子IL-4(血浆中p<0.001,BALF中p=0.008)、IL-5(血浆中p=0.003,BALF中p=0.012)浓度降低,GATA3基因表达(p=0.012)降低;Th1相关细胞因子IFN-γ血浆中浓度(p=0.002)升高(BALF中p=0.052),T-bet基因表达(p=0.038)升高;Th9相关细胞因子IL-9浓度降低(血浆中p<0.001,BALF中p=0.005),Th17相关细胞因子IL-17A变化无统计学意义(血浆中p=0.056,BALF中p=0.985)。结论:1、成功筛选出一种高微生物负荷的母鼠-子鼠过敏性气道疾病模型,刺激条件为1mg/kg的泛福舒于母鼠妊娠期间灌胃,能分娩出过敏性气道疾病模型特征减轻的子代。2、母鼠的肠道微生物负荷的增加可以上调其结肠中Toll样受体2和Toll样受体4的表达,向结肠黏膜下淋巴组织中传递,并且增加所产子鼠肺部Toll样受体2和Toll样受体4的表达。3、在子鼠早期过敏性气道疾病模型中,高微生物负荷母鼠所产子鼠的肺部组蛋白去乙酰化酶9表达下调及叉头状转录因子3的表达上调,脾脏调节性T细胞比例增加。进而纠正Th1/Th2的失衡,增强对Th9细胞的抑制作用。