禽大肠杆菌病是由禽大肠杆菌(avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的一种局部或全身性感染的急性或慢性传染性细菌疾病的总称,给世界范围内的养禽业造成的严重的经济损失。脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS),又称内毒素,是革兰氏阴性菌细胞外膜的主要成份。研究表明,LPS分子中真正具有内毒素活性的基团是类脂A。大肠杆菌类脂A的合成包括10步,其中后期酰基转移酶LpxL和LpxM主要负责在由2个UDP-氨基葡萄糖和4个脂肪酸链构成的兼性分子DSMP上加上月桂酸(C12：0)和肉豆蔻酸(14：0),从而形成完整的lipid A分子。在冷激(12℃)情况下,LpxP负责在DSMP上加上一个棕榈烯酸(16：1)替代月桂酸。LpxL.LpxM和LpxP分别由lqxL(htrB)、lpxM(msbB)和lqxP(ddg)基因编码。大量研究表明,类脂A的脂肪酸链数量与结构与其激活宿主天然免疫系统和致病能力密切相关。目前类脂A后期酰基转移酶和APEC致病性之间的关系尚未见报道。本研究通过构建APEC优势血清型02：K1菌株E058lqxL、lqxM和lqxP基因缺失突变株,探讨其免疫学特性以及与禽类致病性之间的关系,旨在了解LPS的致病机理,为开发大肠杆菌LPS疫苗提供理论依据。1.禽致病性大肠杆菌E058株lpxL、lpxM和lpxP基因突变株的构建及其生物学特性‘本研究运用λ-Red重组方法构建了E058株lqxL、lqcM和lpxP单基因突变株E058△lpxL. E058△lpxM和E058△lpxP以及双基因突变株E058△lpxL△lpxP. E058△1pxM△lpxP和E058△lpxL△lpxM,并通过质粒pCP20去除氯霉素抗性标记。同时将含lpxL、lqxM和lqxP完整阅读框的质粒pGEX-6P-1-1pxL.pGEX-6P-1-lpxM和pGEX-6P-1-lpxP电转化相应单突变株,从而获得回复株ReE058△lpxL.ReE058△lpxM和ReE058△lpxP.阅读框分析显示lqxL、lqxM和lpxP基因均拥有独立的阅读框,Southern blot和RT-PCR结果表明,lpxL.lpxM和lpxP基因缺失突变株只破坏了目的基因本身,对其上下游基因的表达均无影响。电镜检查显示lqxL和lpxM基因突变株细胞表面的突起大幅减少。SDS-PAGE电泳结果显示,lpxL和lpxM突变株分子量发生明显变化。GC分析LPS结构发现lqxL突变株失去了一条次级月桂酸链(C12：0),而lpxM突变株失去一条次级豆蔻酸链(C14:0),lqxP单突变株LPS未受影响。在LB中,37℃或42℃培养条件下,lpxL和lpxM基因突变株生长速度受影响；不管是在37℃还是在42℃,所有菌株在基础培养基中的生长速度几乎没有差别,但均慢于其在LB中的生长速度。LAL试验结果显示,当细菌浓度为OD600=0.1时,除E058AlpxLAlpxM外,野生株和突变株之间的内毒素含量无显著差异。与野生株E058相比,lpxL突变株对大多数抗生素的敏感性都有极为显著的增加,而E058AlpxP的敏感性无明显变化。血清杀菌试验证明lpxL基因突变对APEC E058抵抗血清杀菌能力有明显影响。巨噬细胞吞噬和胞内存活试验表明lpxL基因突变株侵袭能力显著下降,且4h后在胞内的存活率显著下降。半数致死量(LDso)除突变株E058Δ1pxP与野生株E058相近外,其余突变株的LDso较E058均有较大程度的下降。24h动态分布试验结果表明,以108CFU的浓度左胸气囊接种,野生株E058在试验鸡的带菌量为脾(3.9×104CFU.g-1)、肺(4.4×104CFU.g-1)、肾(9.7×103CFU.g-1)、心血(8.7×101CFU.g-1)和肝脏(9.2×102CFU.g-1).突变株E058ΔlpxP和E058ΔlpxMΔlpxP与野生株相近。而E058ΔlpxL、E058ΔlpxM、 E058ΔlpxLΔlpxP和E058ΔlpxLΔlpxM心血中均未分离到相应菌株。突变株E058ΔlpxL肝脏1.3CFU.g-1,脾5.6CFU.g-1in snleen,肺2.9×102CFU.g-1.肾9.5×101CFU.g-1.显著低于野生株；E058ΔlpxM在肺和肾中的分布量与E058无显著差异,肝中的分布量为3.4CFU.g-1,脾中分布量为1.4×102CFU.g-1,下降显著。E058ΔlpxLAlpxP在肝、脾、肺、肾中的分离量显著低于野生株。突变株E05SΔlpxLAlpxM在肝中未能分离到菌株,与野生株相比在脾、肺和肾中下降极显著。以浓度为1×1011CFU浓度的E058ΔlpxL和E058ΔlpxLAlpxM接种试验鸡,结果显示从各脏器中分离到E059ΔlpxL或E058ΔlpxLAlpxM菌量较108CFU接种量的上升10-100倍,与接种108CFU E058的相应脏器分离量相比,除心血中有显著下降外,其他脏器差异不显著。回复株ReE058ΔlpxL和ReE058Δ/pxM在各脏器的分布量与野生株E058相近。病理学检验发现E058、E058ΔlpxP和E058ΔlpxMΔlpxP对试验鸡的损伤较严重,突变株E059ΔlpxM引发的损伤较轻,突变株E058ΔlpxL和E05SΔlpxLΔlpxP几乎没有肉眼可见的病理学变化。结果提示lpxL和lpxM基因与SPF鸡的致病力有关。2.E058及其突变株E058ΔlpxL、E058ΔlpxM和E058ΔlpxP来源LPS对LPS相关信号途径及LPS诱导的细胞凋亡的影响本研究用热酚法提取E058ΔlpxL、E058ΔlpxM和E058ΔlpxP来源LPS,并用其体外刺激鸡巨噬细胞系HD11和小鼠巨噬细胞系RAW264.7,检测细胞信号途径及其细胞因子随时间的变化,同时研究LPS刺激鸡体后不同脏器中主要信号分子及细胞因子的表达差异。结果显示,由于鸡体内缺乏脂多糖结合蛋白(Lipopolysaccharide binding protein, LBP),鸡对LPS的敏感程度要远低于小鼠。随着时间的推移,LPS相关的信号途径相关分子TLR4、MyD88、IRAK4、TRAF6、TAB、TAK1、TAKα/β和转录因子NF-κB在LPS刺激后2h内被依次激活,而后逐渐下降。最后,产生IL-1β、IL-6、IL-8、IL-18、IFN-α、IFN-β、IL-10和溶菌酶等活化产物。与野生株来源LPS相比,突变株E058ΔlpxP来源LPS刺激细胞活化的能力无明显差异,而突变株E058ΔlpxL, E058ΔlpxM来源LPS激活细胞的能力与野生株相比显著下降,但在到达峰值后下降的速度要比野生株和突变株E058ΔlpxP来源LPS处理组慢。NLRC5的变化趋势呈振荡上升,到6h时达到高峰,E058ΔlpxL和E05SΔlpxM来源LPS处理组在各时间段均低于其他组。NO产量变化与其他分子变化趋势基本一致。试验鸡脏器分布结果显示,TLR4和NF-κB的分布规律基本一致,均在脾中表达量最高,而NLRC5在各脏器中的表达量无明显差别。通过用Caspase-3检测细胞凋亡试验显示,野生株E058与突变株E058ΔlpxP来源的LPS处理组的细胞凋亡程度显著高于E058ΔlpxL和E058ΔlpxM来源LPS处理组。3.E058lpxL、lpxM基因突变株E058ΔlpxLΔlpxM的免疫效力研究本研究将lpxL、lpxM双基因突变株E058ΔlpxLΔlpxM制备成灭活苗和弱毒活疫苗,通过ELISA方法检测其对E058全株、OMPs和LPS抗原的保护力,结果证明突变株E058ΔlpxLΔlpxM高浓度活疫苗及灭活疫苗均能有效地诱导机体针对E058全菌、OMPs和LPS的体液免疫和细胞免疫应答,并可提供88.9%和81.5%的保护率,而突变株E058ΔlqxLΔlpxM低浓度活疫苗缺乏针对以上抗原的保护力。淋巴细胞增殖试验结果显示,灭活疫苗组和活疫苗高浓度组的刺激指数(SI)值与PBS对照及活疫苗低浓度组相比差异显著。