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Copines蛋白家族是近期发现的一类进化保守的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白,该家族蛋白有两个保守结构域:N端两个C2 domain,是结合钙和磷脂的部位,已知蛋白激酶C、磷脂酶C和突触结合蛋白等也有该结构域;C端的A domain,类似于整合素(integrin)中的A domain,具有蛋白质相互作用位点,是结合靶蛋白的结构域。CPNE5定位于第6号染色体的6p21.1基因座,含一个1782bp的开放阅读框,编码593个氨基酸的蛋白。本研究主要围绕CPNE5对TNF-a诱导的NF-kB转录激活活性的影响及其作用机制,以及CPNE5在细胞凋亡方面的作用进行了研究。在HEK293细胞中,TNF-a诱导CPNE5 mRNA表达显著上调。含有NF-κB调控靶序列的双荧光素酶报告基因实验结果表明,外源表达CPNE5能够抑制TNF-a诱导的NF-κB的转录激活活性。RT-PCR实验显示,过表达CPNE5抑制了NF-κB下游基因Bcl-2等在核酸水平的表达。为研究CPNE5保守区域A domain在CPNE5抑制NF-κB活性中的作用,我们构建了C2结构域缺失的AD(A domain)的GFP表达载体,发现AD-GFP融合蛋白在细胞内呈弥散表达,不同于CPNE5的定位。我们发现AD的高表达,可以显著地抑制TNF-a所诱导的NF-κB转录激活活性,且这种抑制作用与AD转染量具有剂量依赖性。这说明CPNE5的AD结构域在其抑制NF-κB转录激活中起到重要作用。在发现CPNE5可以显著抑制TNF-a对NF-κB的转录激活的基础上,我们进一步对抑制机制进行了研究。首先我们在HEK293细胞中建立了CPNE5的四环素诱导表达系统(Tet-on)。经过Zeocin筛选,我们挑取了7个pcDNATM 4/TO-CPNE5 T-Rex-293细胞克隆株。这些细胞株经四环素诱导12h~24h后,目的蛋白CPNE5有不同程度的表达。我们选取诱导表达量较高的细胞株,研究高表达CPNE5抑制NF-κB转录激活的机制。Western-blot结果显示,CPNE5高表达并不影响NF-κB亚单位p65的入核。细胞免疫荧光实验结果也验证了这一结果,正常HEK293细胞中,TNF-a刺激能诱导NF-κB的快速入核。Western blot实验和细胞免疫荧光实验结果均表明,外源高表达CPNE5没有阻止TNF-a诱导的NF-κB入核。这些结果表明,CPNE5不通过NF-κB出入核调节机制来抑制NF-κB的活性。凝胶阻滞实验结果表明,CPEN5过表达抑制了NF-κB的DNA结合活性。免疫共沉淀(co-IP)实验结果表明,外源表达的CPNE5和NF-κB(P65)有相互作用。为研究CPNE5是否如CPNE1一样可以剪切P65或P50,我们过表达CPNE5后再进行TNF-a处理,Westernblot检测未发现P65/P50有剪切体出现,这表明CPNE5没有如同家族的CPNE1一样诱导P65或P50的剪切。为研究外源表达CPNE5是否因为抑制了NF-κB的活性,从而抑制了TNF-a诱导的与细胞生存相关的信号通路,进而促进了TNF-a诱导的细胞凋亡,我们研究了外源表达CPNE5对TNF-a诱导的细胞凋亡的影响。与空载体转染组相比,外源表达CPNE5的HEK293细胞,在TNF-a作用后,细胞形态学上出现特征性的凋亡改变,如细胞外形模糊、细胞皱缩、细胞体积缩小等。流式细胞术检测结果显示,TNF-a处理12h或24h时,实验组细胞凋亡率高于对照组。分析介导凋亡的信号分子发现,凋亡核心成员半胱氨酸-天冬氨酸蛋白酶(caspase)的切割底物PARP参与了此过程。Western Blot结果表明,外源表达CPNE5促进了PARP的剪切。以上结果表明,CPNE5可以在一定程度上促进TNF-a诱导的细胞凋亡。而外源表达CPNE5对CHX和TNF-a(-/+)诱导的细胞凋亡无显著的影响。CHX是一种真核细胞蛋白翻译的常见抑制剂,它可以通过抑制核糖体亚基肽转移酶活性来阻止蛋白质的合成。以上实验结果表明CPNE5和CHX促进TNF-a诱导细胞凋亡的效应有重叠,这提示二者促凋亡机制可能有类似之处,即通过抑制抗凋亡蛋白的合成促进凋亡。我们在检测NF-κB下游基因时,发现一个有趣的现象:无TNF-a诱导时,过表达CPNE5能够显著增强NF-κB下游基因Bcl-xL的蛋白表达水平。此时,NF-κB的转录调控活性并没有被激活。Bcl-xL属于Bc1-2家族I类成员,具有抑制细胞凋亡的作用,已有报道表明Bcl-xL也参与了TNF-a对NF-κB活性的调控。进一步调研文献发现,Bcl-xL的表达除了受NF-κB调控外,还有很多因子可以调控它的表达,其中重要的如STATs和Ets等。由此,我们推测过表达CPNE5可能通过一条不依赖NF-κB活性的信号通路促Bcl-xL表达,而正由于Bcl-xL这种表达水平的升高,导致了尽管CPNE5有效地抑制了NF-κB的转录激活活性,却依然没有显著促进NF-κB诱导的细胞凋亡。为验证这一设想,我们钓取了人Bcl-xL基因并将其构建到真核表达载体。双荧光素酶报告基因实验结果显示,过表达Bcl-xL能够抑制NF-κB转录激活活性;转染Bcl-xL的RNA干涉片段SiRNA-BclxL,降低了Bcl-xL的表达同时弱化CPNE5对NF-κB活性的抑制,表明Bcl-xL可能在CPNE5抑制NF-κB转录激活活性过程中发挥重要的作用。本研究内容概括为:1.外源表达CPNE5抑制了TNF-a诱导了NF-κB的转录激活活性;CPNE5的A结构域也有这种抑制作用,并且呈现剂量依赖性;2. CPNE5不影响p65的出入核,表明CPNE5不通过NF-κB出入核调节机制来抑制NF-κB的活性,但CPEN5抑制了NF-κB与DNA结合的活性,且可以和P65相互作用;3. CPNE5促进了TNF-a诱导的凋亡率增加;但对CHX或TNF-a/CHX诱导的细胞凋亡无影响;4.成功钓取Bcl-xL基因;发现CPNE5表达诱导Bcl-xL表达水平上调;过表达Bcl-xL抑制NF-κB活性,SiRNA-BclxL弱化CPNE5对NF-κB活性的抑制,表明Bcl-xL可能参与CPNE5抑制NF-κB活性的过程。我们的研究首次证明了CPNE5及其保守结构域AD对NF-κB的转录激活具有抑制作用,其机制为CPNE5抑制NF-κB DNA结合活性,且可能和CPNE5与P65的结合有关。我们也研究了CPNE5对细胞凋亡的影响。过表达CPNE5抑制NF-κB的活性且促进凋亡。尽管过表达CPNE5也会上调Bcl-xL的表达,但在整个TNF-a诱导的细胞凋亡过程中,过表达CPNE5总体上呈现促凋亡的效应。