腺病毒由于具有可以感染处于分裂期和非分裂期的肿瘤细胞,不整合到细胞的染色体中,无插入致突变性,安全性好,且其高效、低毒、容量大、特异性强、在细胞内不易降解等特点成为良好的基因转运载体。我们利用肿瘤细胞中端粒酶阳性和肿瘤内缺氧这两大特性为依据,用人端粒酶逆转录酶（hTERT）启动子及缺氧反应（HRE）启动子来分别调控腺病毒增殖相关基因 E1A和E1B,从而使病毒的增殖局限在端粒酶阳性和缺氧的肿瘤细胞中。具体的实验方法是:先后经过两次定点突变重叠PCR技术,分别使野生型腺病毒E1A和E1B的内源性启动子缺失,并在缺失处引入酶切位点。将全基因合成的人端粒酶逆转录酶启动子hTERT和缺氧反应启动子HRE分别插入E1A和E1B基因的上游,同时为了方便后续的检测,我们在HRE启动子的前面、E1A蛋白表达基因的后面插入了绿色荧光蛋白报告基因,即得到由 hTERT和HRE分别调控的E1A、E1B 基因表达且携带 GFP 的重组腺病毒穿梭质粒载体pXC1-hTERT-GFP-HRE。将穿梭质粒 pXC1-hTERT-GFP-HRE 与含野生型腺病毒Ad5载体右臂的骨架质粒pBHGE3i共同转染低传代的293细胞,使两质粒在细胞内进行同源重组。转染后9-10天出现病毒空斑,此时收集细胞和病毒,反复冻融收集病毒,并将此腺病毒载体命名为KGHV200。反复扩增该重组腺病毒,并对病毒液进行浓缩,TCID50方法对浓缩后的KGHV200病毒进行滴度的测定。实时荧光定量PCR检测KGHV200感染人肝癌细胞株HepG2时发现E1A和E1B基因的表达量比在正常人胚肺二倍体细胞中的高2万倍,说明我们构建的双肿瘤特异性启动子能够在肿瘤细胞中成功调控E1A和E1 B基因的表达。荧光显微镜镜检观察病毒的增殖实验:将携带绿色荧光蛋白报告基因的腺病毒载体KGHV200以相同的滴度（MOI=0.1）感染正常人胚肺二倍体细胞KMB17和几株端粒酶阳性的肿瘤细胞MCF-7、MDA-MB-435、XWLC-05、HepG2和HCT116,分别在感染后第3天、第7天、第9天和第1 2天观察绿色荧光蛋白的表达情况,发现在正常人胚肺二倍体细胞中荧光分散、单簇存在,而在肿瘤细胞中荧光的表达由单一、分散逐渐变为广泛、集中、融合存在,并且在第1 2天以后荧光慢慢淡去,细胞成团漂浮、死亡,直观的反应了 KGHV200病毒在被感染肿瘤细胞中复制、增殖,并裂解细胞的过程。病毒增殖实验:用相同滴度（MOI=5）的KGHV200病毒分别感染正常人胚肺二倍体细胞株和不同肿瘤细胞株（人乳腺癌细胞系MDA-MB-435、人肝癌组织细胞HepG2、人结肠癌HCT-116、宣威肺癌XWLC-05和人胃癌细胞系SGC9701）,在感染后24h、48h和100小时分别收集病毒,用TCID50法检测各个时间段及每株细胞中病毒的滴度,与感染0h时的病毒滴度作对比,发现KGHV200在肿瘤细胞中能够大量增殖,而在正常细胞中增殖倍数很低。综上所述,本实验室成功构建了由双肿瘤特异性启动子调控的肿瘤特异性增殖腺病毒载体,通过体外实验验证了该重组腺病毒在肿瘤细胞中能够特异性高表达增殖相关基因E1A和E1B,并且能特异性的在不同的肿瘤细胞中持续、高效的复制和增殖,为基因治疗提供理想的转运载体。