目的:测定替加环素等抗菌药物对产KPC肺炎克雷伯菌的最低抑菌浓度(MIC),将蒙特卡洛模拟与PK-PD模型结合,评价替加环素和米诺环素治疗产KPC肺炎克雷伯菌感染的临床疗效:测定替加环素、米诺环素与氨基糖苷类抗菌药物对产KPC肺炎克雷伯菌的体外联合抗菌作用;测定替加环素等抗菌药物的单药和联合防耐药突变浓度(MPC)、耐药突变选择窗(MSW),评价替加环素与其他抗菌药物联合应用限制耐药发生的能力;建立大鼠组织笼感染模型,在体内初步验证联合用药疗效及限制耐药发生能力:对耐药突变菌株进行链特异性转录组测序等研究,探索替加环素联合氨基糖苷类抑制耐药发生的可能机制。方法:(1)采用琼脂平板稀释法测定替加环素等抗菌药物对68株产KPC肺炎克雷伯菌的MIC,并结合临床替加环素和米诺环素的PK数据,计算不同MIC时的PK/PD参数,再根据疗效判定折点值,利用蒙特卡洛模拟计算不同剂量下的达标概率(PTA)和总体疗效——累计反应分数(CFR)。(2)参照棋盘法设计,采用微量肉汤稀释法测定替加环素、米诺环素与阿米卡星、庆大霉素对不同敏感类型菌株的联合MIC和部分抑菌浓度指数(FICI):采用时间-杀菌曲线法,动态观察体外两种抗菌药物联用对细菌生长的影响,判断联合用药的协同性。采用琼脂平板稀释法测定替加环素、多黏菌素E及阿米卡星单药和联合用药的MPC,计算单药及联合的MSW,分析单药MSW与联合用药MSW的相关性。(3)建立大鼠组织笼感染模型,分别给予不同剂量的替加环素和阿米卡星单药、联合用药治疗,观察给药7天后组织笼内细菌量、耐药突变频率、MIC等变化,测定耐药突变菌株的生长曲线。(4)对体外筛选的耐药突变菌株进行链特异性转录组测序,分析不同抗菌药物压力下筛选的耐药突变菌株转录表达差异,利用PCR测定临床及体外筛选菌株四环素类和氨基糖苷类耐药基因,利用RT-PCR测定替加环素和米诺环素耐药突变菌株外排泵基因acrB及其调控基因ram4的表达情况,通过流式细胞仪测定氨基糖苷类耐药突变菌株细胞膜电位变化情况。结果:(1) 68株产KPC肺炎克雷伯菌对美罗培南、头孢他啶、头孢噻肟、氨曲南均耐药;多黏菌素E敏感率为97%;替加环素按不同折点判定的敏感率差别较大,MIC50和MIC90分别为1mg/L和2mg/L;米诺环素敏感率为50%;氨基糖苷类中阿米卡星的敏感率要高于庆大霉素,分别为51.5%和32.4%。蒙特卡洛模拟分析表明,不论PK/PD折点为AUC0-24h/MIC > 6.96,还是fAUC0-24h/MIC > 0.9,替加环素说明书剂量(50 mg/L q12h)及剂量加倍后的方案治疗产KPC肺炎克雷伯菌感染时均不能达到CFR > 90%目标值;以AUC0-24h/MIC > 25作为折点,米诺环素说明书剂量(100 mg/L q 12h)及剂量加倍后的方案也均不能达到C F R > 90%。( 2 )对于氨基糖苷类敏感菌株,50%以上菌株中替加环素或米诺环素联合氨基糖苷类的FICI ≤ 0.5,其余菌株的FICI在0.5到1之间;对于氨基糖苷类高度耐药菌株,替加环素或米诺环素与氨基糖苷类间并无明显协同作用,FICI均大于1。时间-杀菌曲线进一步验证了棋盘法的结果。替加环素对产KPC肺炎克雷伯菌的MPC值为4-32 mg/L,多黏菌素的MPC值为64- >128 mg/L,阿米卡星的MPC值为32-128 mg/L。替加环素联合阿米卡星对4株细菌的MSW均值为12.0,显著低于替加环素联合多黏菌素E的200.1和多黏菌素E联合阿米卡星的372.4,联合用药MSW与单药MSW有显著相关性。2MIC浓度的多黏菌素E联合2 MIC替加环素或阿米卡星的耐药突变频率仅比单药降低10-100倍:1 MIC替加环素联合1 MIC阿米卡星的耐药突变频率比单药降低了 1000-10000倍,2MIC浓度的两种药物联合则可完全抑制耐药突变菌生长。(3)大鼠组织笼感染模型中,给药组的细菌量变化与空白对照有显著统计学差异,联合用药组细菌量下降幅度最大,与4组单药组相比均有统计学差异;替加环素或阿米卡星组与空白对照组间的细菌耐药突变频率在给药前并无明显统计学差异;给药7天后,替加环素单药的两组中细菌耐药突变频率较前明显增加,1MIC浓度的耐药突变频率由原来的10-6上升为10-2左右;2MIC浓度时的耐药突变频率上升为10-3左右,且两组中各有2只大鼠笼内细菌的替加环素MIC变为原来2倍。联合用药组中,在替加环素1MIC浓度时,仅有一只大鼠的耐药突变频率为2.12×10-3,其余大鼠未有菌落生长,2MIC浓度时也未见菌落生长。(4) Kp46号菌株及其米诺环素和替加环素耐药突变菌株中均未检出与四环素类耐药相关的tet基因;Kp46及阿米卡星耐药突变菌株中检出aac(3)Ⅱ、aac(6’)-I、ant(3")-I基因。转录组测序发现,这些基因并未表达或未表达增高,阿米卡星耐药可能与翻译延长因子和多胺/腐胺转运表达增高、NADH脱氢酶和K+-H+逆向转运体表达降低相关;庆大霉素耐药产生可能与抗氧化压力相关的Cpx系统表达增高、细胞色素表达降低相关。此外,庆大霉素耐药菌株中还检测到30S核糖体蛋白S22表达明显降低,这也可能与庆大霉素耐药相关。与临床敏感菌株相比,氨基糖苷类耐药突变菌株的细胞膜电位有显著降低。不论是替加环素还是米诺环素,耐药产生主要与外排泵表达增高相关。替加环素耐药菌中ramA和acrB的平均相对表达水平分别增高了 70.4倍和6.8倍;米诺环素耐药菌中ramA和acrB的平均相对表达水平分别增高了 11.6倍和3.6倍。结论:(1)产KPC肺炎克雷伯菌仅对多黏菌素、替加环素、米诺环素和阿米卡星有较高的敏感率,且替加环素、米诺环素的MIC值显著高于非产KPC菌株;结合临床PK/PD参数的蒙特卡洛模拟分析表明,不论是说明书推荐剂量,还是剂量加倍,替加环素和米诺环素单药治疗产KPC肺炎克雷伯菌感染的总体疗效并不理想。(2)替加环素或米诺环素联合氨基糖苷类对两者均敏感菌株有很好的协同抗菌活性,多黏菌素、替加环素和阿米卡星单药的MPC高、MSW宽,替加环素与阿米卡星联合可以有效缩小甚至关闭MSW,较好抑制耐药发生。(3)替加环素和阿米卡星单药治疗较易导致体内耐药突变菌株富集,联合用药疗效优于单药,且耐药突变频率显著降低,提示联合用药可抑制细菌耐药发生。(4)替加环素联合氨基糖苷类抑制耐药发生的机制可能与不同耐药突变菌株对细胞膜电位差需求不同相关。