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研究背景及目的意义:多发性硬化(multiple sclerosis,MS)是中枢神经系统常见的自身免疫性疾病,免疫调节异常在疾病的发生发展中起到重要作用。迄今为止,MS尚缺乏有效的治疗。实验性自身免疫性脑脊髓炎(experimental autoimmune encephalomyelitis,EAE)是MS的经典动物模型,许多能够改善EAE症状的治疗同样也适用于MS患者。树突状细胞(dendrtic cell,DC)作为效力最强的抗原提呈细胞,既能启动自身反应性免疫应答,又可促进并维持免疫耐受,能够促进并维持免疫耐受的DC称为耐受性DC(tolerogenic DC,t DC)。t DC在治疗自身免疫性疾病中越来越受到国际学者的关注。本实验拟在体外应用具有免疫调节作用的1,25(OH)2D3诱导骨髓来源的DC形成t DC,分析其细胞表面分子表型,并将这些t DC回输给已经发病的EAE小鼠,观察治疗后EAE症状的变化,探究1,25(OH)2D3诱导的t DC对EAE小鼠特异性免疫耐受的作用。研究方法:1、用MOG35-55加完全弗氏佐剂(complete Freund’s adjuvant,CFA)混合乳液,皮下注射C57BL/6小鼠,并于免疫当天及48小时后腹腔注射百日咳毒素(pertussis toxin,PTX),诱导建立EAE模型。2、用IL-4和GM-CSF诱导小鼠胫骨和股骨骨髓来源的单个核细胞形成DC。在正常DC培养基础上加入1,25(OH)2D3来诱导t DC的形成。向正常DC和t DC分别加LPS刺激24小时,促进其成熟。通过流式细胞术检测DC、t DC表面分子(MHC-II、CD86、CD80和CD83),分别比较未加LPS刺激的DC和t DC表型以及LPS刺激后DC和t DC表型的差异(用平均荧光强度表示分子表达量的多少)。3、在DC/t DC诱导的第8天,用MOG抗原孵育DC/t DC 4小时后,将MOG抗原洗尽后,经尾静脉注射回输给EAE小鼠(EAE小鼠诱导第10、13、16天),对照组给予PBS注射,观察各组的临床症状变化。4、在回输治疗发病高峰期分离各组小鼠脊髓,通过HE染色,观察各组脊髓炎症细胞浸润情况。5、在回输治疗发病高峰期内眦静脉取血法获得各组小鼠外周血,离心后吸取血清,通过CBA检测IL-6、IL-17的表达情况。研究结果:1、MOG35-55和CFA混悬后皮下注射能够有效的诱导C57BL/6小鼠成为EAE模型,在免疫后第12~14天开始发病,第20天左右达到发病高峰。2、正常DC和1,25(OH)2D3诱导的t DC均在培养第8天进行流式检测,发现正常DC和t DC的CD11c+比例分别为90.0%、95.9%。t DC表面的MHC-II(P=0.045)、CD86(P=0.028)与DC相比均是下降的,而CD83(P=0.288)无明显下降;而CD80(P=0.135)则有所升高,但无统计学意义。加入LPS后,t DC表面的MHC-II(P=0.024)、CD86(P=0.038)与DC相比均是下降的,而CD83(P=0.670)无明显下降;而CD80(P=0.025)则显著升高。3、随机将小鼠分成四组:空白对照组、PBS回输组、DC回输组及t DC回输组,其中空白对照组是并未诱导成为EAE模型的正常小鼠,其余三组均为成功诱导EAE模型小鼠。诱导EAE后,于第10天、13天、16天分别给四组小鼠经尾静脉注射PBS、PBS、DC和t DC后,空白对照组一直未发病,其余三组均发病。其中DC回输组和t DC回输组小鼠症状较PBS回输组轻,且t DC减轻效果更明显。4、在回输治疗发病高峰期分离各组小鼠脊髓,进行HE染色,空白对照组脊髓内无炎症细胞浸润,而其余三组均可见炎症细胞浸润,以脊髓脊膜、血管周围尤著,可见小血管周围有血管套袖形成。其中DC回输组和t DC回输组小鼠炎症浸润较PBS回输组减轻,且t DC炎症浸润的最少。5、EAE回输治疗后在发病高峰时,各组小鼠外周血清IL-6、IL-17的表达情况为PBS回输组?DC回输组?t DC回输组,但组间比较差异无统计学意义。结论:1、应用MOG35-55加FCA免疫C57BL/6小鼠可成功诱导EAE模型;2、1,25(OH)2D3在体外可以诱导出t DC;3、t DC回输能有效减轻EAE临床症状;4、t DC回输能够有效减轻EAE小鼠脊髓炎性细胞浸润。