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猪繁殖与呼吸综合征(PRRS),是一种以引起猪繁殖障碍和呼吸道疾病为主要特征的急性传染病。不同品种、性别、年龄的猪只均可感染,该病流行范围广,发病率高,严重影响了养猪业的健康发展。研究表明,在PRRSV结构基因中目前已知的具有良好免疫原性的糖蛋白主要有GP4(ORF4编码)、E (ORF5编码)和M (ORF6编码)。其中,E、M蛋白具有诱发中和抗体的能力,M蛋白还具有诱发特异性细胞免疫功能。因此,E、M蛋白基因是开发PRRS核酸疫苗重要的候选基因。同时,研究表明Hsp70具有免疫优势抗原的特点,能诱导出特异性Thl型细胞反应,能参与调节提高机体的免疫反应。基于此,本研究以PRRSVSCQ株的ORF5、ORF6以及卡介苗(结核杆菌的减毒菌)中的Hsp70为研究对象,构建了含有Hsp70和PRRSV ORF5、ORF6的核酸疫苗；通过小鼠免疫实验,分析该核酸疫苗在小鼠体内诱导的免疫水平与效果,为进一步研究PRRS核酸疫苗在临床上应用提供基础数据和实践依据。本课题主要研究内容包括：Ⅰ.携Hsp70序列的PRRSV ORF5、ORF6基因重组质粒构建及表达研究本研究在实验室原有构建好的质粒pMD 19-T-ORF5、pMD 19-T-ORF6、pMD19-T-Hsp70的基础上,参照GenBank中收录的PRRSV SCQ株基因序列,重新设计4对引物,将ORF5、ORF6、Hsp70基因进行扩增,分别克隆至SimplepMD19-T载体上,经PCR、双酶切和序列测定鉴定正确后,将其分别命名为pMD19-T-ORF5、pMD19-T-ORF6、pMD19-T-Hsp70;将ORF5与ORF6基因串联,克隆至Simple pMD19-T载体上,获得串联基因ORF5-ORF6,经PCR、EcoRⅠ和XbaⅠ双酶切和序列测定鉴定正确,将其命名为pMD19-T-ORF5-ORF6;回收鉴定正确的重组质粒pMD19-T-ORF5-ORF6中的ORF5-ORF6片段,将其克隆至表达载体pCI-neo,成功获得重组表达质粒：含终止密码子的pCI-ORF5-ORF6A与不含终止密码子的pCI-ORP5-ORF6B。然后经EcoRⅠ和XbaⅠ鉴定重组质粒,XbaⅠ和SmaⅠ酶切回收Hsp70,与pCI-ORF5-ORF6B一起构建融合表达质粒pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70;将重组质粒转染COS-7细胞进行表达研究,经IFA方法检测,结果显示转染重组质粒pCI-ORF5-ORF6A及pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70的Cos-7细胞浆中均出现特异性的绿色荧光；Western-blotting分析结果显示,重组质粒的表达蛋白分别在42.7Ku、112.2 Ku出现反应条带,大小与预期大小相符,说明ORF5、ORF6、Hsp70蛋白具有一定的生物学免疫反应活性。重组质粒的成功表达为进一步进行PRRS核酸疫苗动物免疫实验奠定了基础。Ⅱ.核酸疫苗pCI-ORF5-ORF6A、pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70在小鼠体内的免疫效果研究将重组质粒免疫小鼠,同时设定PRRS活疫苗、pCI-neo空载体及空白对照组,免疫三次,每次间隔14天,每隔2周尾尖采血分离血清,检测细胞因子IFN-γ、IL-4、脾T淋巴细胞亚群数量(CD4+和CD8+)、淋巴细胞增殖反应(MTT法)水平及中和抗体水平。IL-4和IFN-γ检测显示,各免疫组IL-4和IFN-γ的含量都有明显变化。其中,pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70疫苗组诱导机体产生的IL-4和IFN-y量均显著高于pCI-ORF5-ORF6A诱导机体产生的IL-4和IFN-y量(P<0.01)。表明Hsp70作为分子佐剂能有效地刺激机体表达IL-4和IFN-y的能力；淋巴细胞亚类检测结果表明,两组中CD4+、CD3+T淋巴细胞亚类数量显著高于空质粒pCI-neo对照组、PBS对照组,CD8+T淋巴细胞亚类数量也高于两对照组；MTT实验显示,免疫前各组脾淋巴细胞增殖能力差异不显著(P>0.05),随着免疫次数的增加,至三免后14d pCI-ORF5-ORF6B-Hsp70组的脾淋巴细胞增殖能力与对照组及pCI-ORF5-ORF6A差异显著(P<0.05),证明Hsp70作为佐剂能有效的刺激脾淋巴细胞的增殖。小鼠免疫实验说明,所构建的含Hsp70的PRRSV共表达基因ORF5/ORF6核酸疫苗能有效诱导机体的体液与细胞免疫应答水平。