目的股骨头缺血性坏死是骨科常见疾患,股骨头坏死是由于股骨头内压力增高,股骨头骨组织不能得到营养血管的正常供血,使股骨头组织中的骨细胞、骨髓、造血细胞、其他细胞发生坏死。治疗股骨头坏死是当今世界的一大难题,股骨头坏死的主要原因是由于股骨头的血运被破坏,从而引起了骨细胞及骨髓成分死亡及随后的修复,继而导致股骨头结构改变、股骨头塌陷、关节功能障碍的疾病。本实验主要是应用组织工程技术,构建组织工程化骨来评估体内血管化的过程,进而为重建股骨头的血运提供一种可行性方案。本实验取新西兰大白兔的骨髓间充质干细胞,应用富血小板血浆(PRP)进行体外培养,然后与生物相容性好的支架材料β-TCP结合进行培养,由于β-TCP三维空间具有更多的延伸方向,有助于控制干细胞生长行为,提高单位扩增速率,适于在微重力体系中模拟体内组织细胞的生长微环境,适应剪切力,促进骨分化。另一方面,β-TCP本身可以作为一种很好的存贮和控释给药系统,在培养过程中逐步释放骨诱导生长因子。最后将复合体放入生物反应器中进行三维培养,构建组织工程化骨,将构建的组织工程化骨植入动物体内,3月后处死动物,取材,标本观察,PCR及ELISA等实验技术来观察血管特异性标志物,从而用来评价该种构建组织工程化骨对于血管化的影响,从而为重建股骨头血运提供一种可行性方案。材料和方法1取2-3月龄的健康的新西兰大白兔,麻醉好后放于实验台,备皮,固定,消毒,铺无菌巾,在无菌条件下用穿刺针抽取双侧胫骨平台内下侧骨髓5ml,梯度密度离心法结合贴壁培养法提取BMSCs,进行原代、传代细胞培养。流式细胞仪鉴定。2经兔耳缘静脉抽取新鲜血液约10ml,在无菌条件下,迅速加入到盛有1ml5%枸橼酸钠的15ml离心管中,轻轻摇晃,防止凝固。3制备富血小板血浆(PRP),将上述离心管中的血液放入离心机中,采用二次离心法制备富血小板血浆,第一次离心3300转／分,第二次离心3000转／分,然后得到无色透明的胶冻状物质即是富血小板血浆。4将制备的富血小板血浆加入到培养基中,3天换液一次,培养BMSCs.5将用富血小板血浆培养的BMSCs制成约1ml的细胞悬液,滴加到β—磷酸三钙(β-TCP)上,构建细胞支架复合体,然后放入生物反应器中用含有富血小板血浆的培养基培养3周。6将在生物反应器中培养的复合体取出,植入到新西兰大白兔的皮下,缝合,三个月以后,取出复合体材料,然后免疫组化检测血管标志物CD31,.第Ⅷ因子关连抗原(VWF)的表达。结果1.对于细胞形态学上的变化,可以采用倒置相差显微镜来观察,1-3日后在显微镜下可以观察到有少量的兔骨髓间充质干细胞贴壁,形状呈不规则的短梭形。数日之后培养瓶中出现细胞集落群,7-8天后,这种细胞集落群广泛出现。两周以后,骨髓间充质干细胞可基本铺满瓶底。铺满瓶底后,进行细胞传代,贴壁较原代细胞快,细胞核较大,胞浆内颗粒较原代细胞多。加入富血小板血浆(PRP)后,细胞的生长速度较以前明显加快,细胞排列规整,呈明显的漩涡状生长。2.β—磷酸三钙(β-TCP)上电镜扫描可见有细胞粘附,细胞伸出伪足和p—磷酸三钙(β-TCP)相连接,细胞在β-TCP多孔陶瓷支架上的黏附、伸展和增殖良好。3.实验组免疫组化结果显示血管标志物CD31,第Ⅷ因子关连抗原(VWF)呈强阳性表现。4.富血小板血浆富含多种细胞因子,可以诱导成骨或软骨,可以促进血管化的过程。结论1.原代细胞培养一天后,于倒置相差显微镜下观察可见有细胞贴壁,呈小圆形。第二天可见有不规则性的骨髓间充质干细胞细胞贴壁,三日后,细胞的形态发生变化,呈不规则的短梭状(图3)。一周后,细胞体积明显增大,培养瓶中出现细胞集落群,数日后,这种细胞集落群广泛出现。两周以后,骨髓间充质干细胞可基本铺满瓶底,呈螺旋簇状生长(图4),细胞可基本长满瓶底,生长均匀,细胞伸展充分,形态均一,并开始向多角型细胞转化,呈明显的旋涡状生长。2.骨髓间充质干细胞是组织工程中较理想的种子细胞。因为骨髓间充质干细胞来源比较丰富,取材也方便,同时分离方法也较简单,采用淋巴细胞分离液可以分离大量的骨髓间充质干细胞,具有稳定的体外培养性能,并且易于传代。3.富血小板血浆富含多种细胞因子,可以诱导成骨或软骨,可以促进血管化的过程。4.β—磷酸三钙(β-TCP)在组织工程支架材料的选择方面具有较多的优势,由于其较好的组织相容性和三维立体结构,所以,骨髓间充质干细胞适合于在β—磷酸三钙(β-TCP)支架材料上黏附和增殖。5.灌注型生物反应器对骨髓间充质干细胞产生力学刺激,可以使细胞在三维支架材料上更好的黏附和增殖。