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甲氧苄啶,是一种临床上广泛应用的广谱抗菌药物,已经应用了半个多世纪,但它的耐药性机制却有待于更深层次的研究。 通过对大肠杆菌基因敲除文库系统地筛选,实验结果表明,敲除mgrB基因、phoP基因、phoQ基因等一些基因能影响大肠杆菌对甲氧苄啶的敏感性。mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶的敏感性能通过导入完整的mgrB基因得到回补。同时,mgrB基因敲除菌株对利福平、链霉素、多粘菌素E也呈现出耐药性。 mgrB基因是PhoP-PhoQ双信号转导系统的负反馈调节因子。为探究mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶产生耐药性的分子机制是由PhoP-PhoQ双信号转导系统介导的,构建了mgrB与phoP双基因敲除菌株、mgrB与phoQ双基因敲除菌株,发现对mgrB基因与phoP基因、mgrB基因与phoQ基因进行双敲除能影响大肠杆菌对甲氧苄啶的敏感性,逆转mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶的耐药表型,证明mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶的敏感性变化是通过PhoP-PhoQ双信号转导系统来介导的。为进一步探究mgrB基因敲除影响大肠杆菌对甲氧苄啶敏感性变化是通过PhoP-PhoQ-PmrK这条路径来实现,在大肠杆菌中敲除pmrK基因,并测试敲除pmrK基因影响大肠杆菌对甲氧苄啶的敏感性变化。药物敏感性实验结果表明,pmrK基因敲除菌株对甲氧苄啶的敏感性并没有发生变化。 前期有研究发现,tolC基因P1启动子上游-44到-29位点可能存在PhoP box,因此,猜测敲除mgrB基因,导致大肠杆菌中phoP基因表达水平上调,进一步导致mgrB基因敲除菌株体内tolC基因表达水平上调。构建了tolC基因超量表达菌株,并测试tolC基因超量表达菌株对甲氧苄啶敏感性的变化。药物敏感性实验结果表明,tolC基因超量表达菌株对甲氧苄啶的敏感性并没有发生变化,证明mgrB基因敲除导致大肠杆菌对甲氧苄啶耐药与mgrB基因敲除菌株中tolC基因表达水平的变化无关。 为更进一步挖掘mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶耐药的原因,利用测定转录组的方法,比较mgrB基因敲除菌株与野生型菌株中基因表达水平的变化情况。实验结果表明,相比于野生型菌株,mgrB基因敲除菌株中phoP基因、phoQ基因、folA基因表达水平都呈现较大幅度的上调。 经过对folA基因启动子的分析,发现了folA基因启动子上游的-50到-36位点上存在TTTAC的重复序列,与PhoP box序列极其相似。通过凝胶迁移实验检测大肠杆菌PhoP蛋白对folA基因启动子区的结合作用。结果表明,当PhoP蛋白使用浓度为25μmol时,对folA基因启动子表现出明显的结合作用,而阴性对照rrsH基因启动子与PhoP蛋白没有出现结合现象,初步判定PhoP能够调控folA基因的转录。 综上所述,我们的研究结果证明,mgrB基因的敲除,导致mgrB基因敲除菌株体内phoP、phoQ基因表达水平的上调,并进一步引起folA基因表达水平的上调即二氢叶酸还原酶的表达水平的上调,最终导致mgrB基因敲除菌株对甲氧苄啶耐药。 通过本课题研究,不仅发现了影响大肠杆菌对甲氧苄啶产生耐药的新机制,也揭示了大肠杆菌中一种新的叶酸代谢调控机制。