胸腔积液是肺、胸膜及其它许多全身疾病的常见临床表现之一，任何病理原因加速其产生和减少其吸收时，就会出现病理性的胸腔积液。 近20余年来，人们相继发现了细胞膜表面的离子通道(如Na<+>、Cl<->、K<+>等离子通道)及多种水通道蛋白(AQPs)，并证实这些通道在细胞内外液体转运中发挥着极其重要的生理功能。水通道蛋白的发现彻底改变了人们对水分子跨越细胞膜转运基本理论的认识。 在与胸膜腔类似的腹膜腔，腹膜问皮细胞及腹膜下毛细血管有AQP1的大量表达；通过AQP1基因敲除的大鼠的动物实验表明，AQP1是腹膜透析中高渗液体超滤中水转运的主要通道。 但目前关于胸膜上的AQP1是否影响胸腔内液体的吸收尚有争议。小鼠脏层胸膜微血管的内皮及问皮细胞上有AQP1丰富表达，在鼠胸膜腔内渗透压增高时对水的转运起主要作用。但在其它引起胸腔液体短时间大量积聚的病理状态如结核、肿瘤性积液时，表达在胸膜上的AQP1的作用及地位如何?目前国内外尚未见报道。AQP1是否在促进病理性胸腔积液的形成中起着始动作用，还需要更深入的研究。 本研究旨在探讨AQP1在结核性胸腔积液大鼠胸膜上表达的变化及其作用，从而揭示结核性胸腔积液胸水转运的机制，并对其治疗提供靶点。主要研究内容如下： 1．建立结核性胸腔积液大鼠的动物模型，观察AQP1在结核性胸腔积液大鼠胸膜组织中的表达。 2．构建克隆有AQP1的复制缺陷型重组腺病毒。 3．重组腺病毒．Ad．rAQP-1感染大鼠胸膜间皮细胞以观察AQP-1基因在胸膜间皮细胞的表达情况及对其影响。 4．胸膜腔注射腺病毒将AQP-1基因转入胸膜，探讨上调AQP-1基因对正常大鼠及结核性胸腔积液大鼠的影响。 第一章.水通道蛋白-1在结核性胸腔积液大鼠胸膜上的表达。 目的： 探讨胸膜上水通道蛋白-1(AQP-1)的表达与结核性胸腔积液大鼠胸水形成之间的关系。 方法： 48只健康Wistar大鼠随机分为实验组和生理盐水对照组，实验组根据动物处死时间分成结核性胸腔积液1d组，3d组，5d组和生理盐水对照组(每组各12只)，实验组胸膜腔内注入0.06mg(2ml)标准人型结核分枝杆菌，对照组则注射等体积生理盐水。应用免疫组织化学检测AOP-1在大鼠胸膜上的分布及蛋白质的表达，实时荧光定量R-．PCR及western blot方法检测各组大鼠AQP-1基因在结核性胸腔积液形成前后胸膜上mRNA及蛋白表达的变化。 小结： 结核性胸腔积液时大鼠脏、壁层胸膜的AQP-1表达增多，AQP-1的增多可能与结核性胸腔积液的形成有关。 第二章.大鼠AQP-1重组腺病毒载体的构建及鉴定。 目的： 构建克隆有大鼠水通道蛋白-1基因(rAQP-1)的重组腺病毒，并观察外源基因在细胞中的表达情况。为后续的动物体内实验奠定基础。 方法： 采用RT-PCR的方法从健康Wistar大鼠新鲜肾脏组织中提取出的总RNA中克隆rAQP-1基因，于Xba Ⅰ和Kpn Ⅰ位点亚克隆入腺病毒穿梭载体成为pAdTrack-CM V．rAQP-1；PmeⅠ将其线性化后与腺病毒基因组载体pAdEasy-1共转染Ecoli BJ5183而同源重组为pAd．rAQP-1；再经PacⅠ酶切后转染HEK-293细胞进行重组腺病毒的包装，利用Western blot和RT-PCR的方法鉴定。经反复感染HEK-293对重组腺病毒进行大规模扩增纯化后，获得的病毒滴度为6.0×10<10>pfu/mL。 小结：采用体外连接法分别成功构建了携带大鼠AQP-1基因的复制缺陷型重组腺病毒载体Ad-AQP-1，且证实其可在293细胞中成功表达目的基因，为研究水通道蛋白-1在结核性胸腔积液中的作用奠定了基础。 第三章.大鼠AQP-1基因干预对结核性胸腔积液的影响研究。 第一节.重组腺病毒Ad．rAQP-1感染rPMCs以及基因的表达目的重组腺病毒Ad．rAQP-1感染大鼠胸膜间皮细胞以观察AQP-1基因在胸膜间皮细胞的表达情况及对其影响。 方法： 无菌操作下采用胸膜腔胰酶消化法获得大鼠胸膜间皮细胞，培养间皮细胞至3代，并使用免疫组化法对细胞进行鉴定。将重组腺病毒感染rPMC并同时做好对照组。细胞分组如下：实验组使用含rAQP-1重组腺病毒(Ad.AQP-1)感染rPMC(loaded rPMC/rAQP-1)；对照组则使用不含AQP-1的重组腺病毒(Ad.GFP)感染rPMC(loaded rPMC/rAQP-1-)。用不同的感染倍数(multiple of infection，m.o.i)的Ad.r AQP-1/Ad.GFP感染rPMC，在荧光显微镜下观察感染效率，并用RT-PCR和Western blot方法检测外源基因r AQP-1在rPMC中的表达情况。并用流式细胞术检测Ad.rAQP-1对胸膜间皮细胞增殖的影响。 小结 ： 1.胸膜腔胰酶消化法可成功的培养大鼠胸膜间皮细胞。 2.重组腺病毒Ad.rAQP-1对胸膜间皮细胞有高的感染效率。 3.重组腺病毒Ad.rAQP-1感染不影响胸膜间皮细胞的生长。 4.生理情况下AQP-1对胸膜间皮细胞的水的转运作用不大。 第二节.上调AQP-1基因表达对结核性胸腔积液大鼠的影响。 目的： 胸膜腔注射腺病毒将AQP-1基因转入胸膜，探讨上调AQP-1基因对正常大鼠及结核性胸腔积液大鼠的影响。 方法： 结核性胸腔积液大鼠模型建立方法同前。36只Wistar大鼠随机分为六组：A组，正常对照组(6只)；B组，结核性胸腔积液组(6只)，大鼠胸膜腔接种0.06mg结核杆菌后3天处死；C组，Ad-rAQP-1+结核杆菌接种组(6只)，大鼠胸膜腔注射5×10<9>PFU重组腺病毒Ad-rAQP-1七天后胸膜腔接种0.06mg结核杆菌，动物于胸膜腔接种结核杆菌后3天处死；D组，Ad-GFP+结核杆菌接种组(6只)，大鼠胸膜腔注射5×10<9>PFU对照腺病毒七天后胸膜腔接种0.06mg结核杆菌，动物于胸膜腔接种结核杆菌后3天处死；E组，Ad-rAQP-1组(6只)，正常大鼠胸膜腔注射5×10<9>PFU重组腺病毒Ad-rAQP-1，注射7天后处死。F组，对照腺病毒Ad-GFP组(6只)，正常大鼠胸膜腔注射5×10<2>PFU对照腺病毒，注射7天后处死。留取胸水及壁、脏层胸膜待检。采用免疫组化方法检测AQP-1蛋白表达。 小结 ： 1．胸膜腔注射Ad-AQP1可有效上调胸膜组织AQP-1表达，胸膜腔是基因治疗的有效部位。 2．单独提高正常大鼠胸膜AQP-1水平不能引起胸腔积液。 3．预先提高胸膜AQP-1的水平，可加速结核性胸腔积液胸水形成。 4．AQP1可能与结核性胸腔积液胸水的形成有关。 结论： 结核性胸腔积液时大鼠脏、壁层胸膜的AQP-1表达增多；重组腺病毒载体Ad．rAQP-1可有效上调胸膜间皮细胞AQP-1表达，为动物体内实验提供一个好的解决方案；胸膜腔是基因治疗的有效部位，胸膜腔注射Ad-AQP1可显著上调胸膜组织AQP-1的表达；预先提高胸膜AQP-1的水平，可加速结核性胸腔积液胸水的产生。研究表明AQP-1在结核性胸腔积液的产生中起着重要作用，可为病理性胸腔积液的防治提供新的思路。