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背景:癫痫是神经系统疾病中仅次于脑血管病以外的第二大疾病,共约有25%的药物难治性癫痫需手术治疗,经手术治疗的患者中约有75%的儿童癫痫和约25%的成人癫痫由局灶性皮质发育不良(Focal cortical dysplasia,FCD)所引起。FCD被认为是大脑皮层形成过程中,神经元的增殖、移行、皮层组建等正常程序受到干扰所致。2011年国际抗癫痫联盟对FCD做出最新分类,认为生后早期任何后天获得性损害,包括外伤、炎症及缺血性损害等均可造成FCD,并称其为FCDⅢd型。
缝隙连接(Gap Junction,GJ)是由相邻两个细胞的细胞膜上相互对应的半通道组成,相邻细胞胞浆由中间连接小体对接而连通,目前认为是相邻细胞间唯一能进行物质和信息直接交换的通道,该通道是非选择性的离子通道,仅可以允许直径小于1.5纳米或者分子量小于1200道尔顿的小分子物质和电流在其间通过,能促进细胞间的电化学偶联和细胞间的新陈代谢。缝隙连接蛋白(Connexin,CX)是由多基因家族编码的一大类膜蛋白,CX在哺乳动物种间具有高度的保守性,大鼠CX氨基酸序列与人类具有高度同源性,382个氨基酸中仅有9个不同,同源性高达97%。至今在人类及哺乳动物中共发现15种,脑内CX43分布最为广泛。
惊厥是大量神经元超同步化放电所致,是细胞内环境稳态被破坏的表现,或者是细胞兴奋或抑制失衡所致。神经元之间的离子产生的电活动在惊厥中起着不可忽视的作用,缝隙连接蛋白被认为是神经元间的电突触的结构学基础。故此,通过缝隙连接蛋白促使相邻细胞形成同步化活动,造成放电的异常播散,有可能是形成癫痫的结构学基础。
目前对FCD发病机制的认识还很肤浅,关于FCD的国内外临床研究较多,多集中在对于手术切除标本的回顾性研究,但较缺乏相应的基础实验研究,FCD的形成机制和致痫机制尚不明了,缺乏稳定的可靠的动物模型。正确建立FCD动物模型对人类疾病病因病机分析,诊断方法探索,针对性的治疗及预后判断有着不可估量的意义。
故此,本实验拟采用液氮冷冻方法探讨制作FCDⅢd动物模型的可行性,并对CX43的表达进行分析。
目的:应用液氮冷冻方法建立FCDⅢd的癫痫大鼠模型并验证,分析CX43在模型中的表达,从而为进一步探讨人类FCD发生机制及未来治疗提供理论及实验依据。
方法:取孕鼠产后第一天乳鼠为实验对象,液氮冷冻新生乳鼠大脑皮层,随机分为实验组和对照组,实验组依据冷冻时间不同分为30秒实验组、60秒实验组和90秒实验组三个亚组。自造模后21天到第8周为实验时间,期间观察实验动物意识状态、行为学,实验第8周监测发作间期脑电图,实验动物满8周时行头颅核磁共振检查,行HE染色及免疫组织化学染色,观察细胞的形态及CX43的表达,最终实验数据以SPSS13.0统计学软件分析。
结果:各实验组不同程度存在精神萎靡,活动减少,不思饮食等表现。行为学中自发性癫痫仅观察到5次,表现为湿狗样颤动,面肌抽动,咀嚼动作增多;节律性点头,洗脸样动作增多;最严重表现为前肢阵挛。实验组脑电图癫痫样放电率平均约为41.6%,各实验组间比较无统计学差异。实验组MRI阳性结果表现为造模部位长T1长T2信号。实验组脑组织切片HE染色见存在层状结构和存在柱状结构紊乱,存在形态异常神经元和气球细胞,FCDⅢd阳性率平均约为75%,60秒、90秒实验组较30秒实验组阳性率明显增高P<0.05,但60秒实验组与90秒实验组比较无统计学差异。CX43每视野阳性细胞数(以均数±标准差表达):对照组19.90±3.221,30秒实验组45.24±3.185,60秒实验组46.15±3.299,90秒实验组46.66±3.230,各实验组阳性细胞数均较对照组明显增多,P<0.05有统计学差异。
结论:液氮冷冻方法可成功建立FCDⅢd动物模型,能够部分模拟人类FCDⅢd,缝隙连接蛋白43在FCDⅢd大鼠中表达增强。