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第一部分：δEF1抑制BMP-2诱导小鼠前成肌细胞C2C12向成骨细胞分化的机制研究δEF1隶属于一类转录因子超家族,该家族成员的结构特征为分子的N-端和C-端各有一个krüpple样锌指结构簇(krüpple type zinc finger cluster),中间为同源盒区域(homeodomain)。δEF1主要在中胚层或外胚层来源的组织中表达。研究发现,δEF1通过两端锌指结构簇与被调控基因上游启动子中CA(C/G)(C/G)TG序列结合而发挥转录抑制功能,可以抑制δ1晶体增强子、I型胶原pro-α1启动子、II型胶原Co12α1启动子以及骨钙素基因的转录。δEF1在骨和胸腺组织中具有十分重要的生物学功能。小鼠δE目的cDNA全长为3351bp,编码一个1117氨基酸的多肽,分子量约为120kD。δEF1基因敲除小鼠表现为胸腺发育缺失以及多部位骨骼发育的严重异常。进一步研究证实δEF1羧基端737-1117氨基酸序列主要参与调控胸腺的发育,氨基端1-727氨基酸序列参与调控骨骼系统的发育,而且δEF1对成骨细胞分化的负调节作用并不仅仅依赖于其转录抑制功能。
本文研究了δEF1在调控rhBMP-2诱导成骨细胞分化过程中所发挥的功能,以及δEF1在BMP/Smad信号转导途径中的呈递关系及与其他信号转导途径的相互作用(crosstalk),为进一步探讨和阐明δEF1调控成骨细胞分化的分子机理提供了依据。
第二部分：乳腺癌细胞MDA-MB-231中δEF1抑制BMP-6诱导E-cadherin转录的机制研究近来越来越多的研究表明,δEF1作为普遍存在的转录抑制因子,通过发挥转录抑制功能在肿瘤发生和转移过程中具有不容忽视的作用。在肿瘤发生、发展过程中,EMT(epithelial to mesenchymal transition)是一个非常关键的步骤。EMT是指细胞的去分化(de-differentiation)过程,即由高分化状态向低分化状态转变,通常伴有E-cadherin表达下调。E-cadherin作为一种重要的细胞粘附分子,它在肿瘤细胞中表达降低会导致细胞去分化,获得侵袭和转移特性。在肺癌中,Ohira等发现δEF1能够特异性地抑制E-cadherin的表达。在乳腺癌中,Eger等发现δEF1异常高表达,并能够有效地抑制E-cadherin在mRNA以及蛋白水平的表达,从而促进乳腺癌细胞EMT的进展。但是,与δEF1调节乳腺癌细胞EMT相关的上游调控因子未见报道。
本文通过前期的半定量RT-PCR分析发现,在入乳腺癌细胞系MCF-7(ER阳性)中,BMP-6和E-cadherin呈高表达而δEF1呈低表达；反之,在MDA-MB-231细胞(ER阴性)中,δEF1呈高表达而BMP-6呈低表达,E-cadherin几乎检测不到表达。进而检测了16例人乳腺癌组织标本(8例ER阳性、8例ER阴性)中BMP-6、E-cadherin以及δEF1在mRNA水平的表达情况,发现87.5％(7/8例)ER阳性的乳腺癌标本中BMP-6和E-cadherin的转录水平相对较高,δEF1的转录水平相对较低；75％(6/8例)ER阴性的乳腺癌标本中δE目的转录水平相对较高,而BMP-6和E-cadherin的转录水平相对较低。这一结果提示,BMP-6、δEF1在乳腺癌细胞EMT中所发挥的作用可能有一定的相关性。为此,本文以δEF1为研究对象,利用定量RT-PCR、荧光素酶活性分析以及Q-CHIP等技术,初步阐明了在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中,BMP-6诱导能够下调δEF1的转录水平,进而影响δEF1对E-cadherin表达的转录抑制作用,全面分析和评价了BMP-6、δEF1在调控乳腺癌细胞EMT中的潜在功能,为更加深入地研究和阐明乳腺癌发生、发展、转移特别是骨转移的机制提供新的线索。为初步证实在乳腺癌细胞中BMP-6对δEF1以及E-cadherin表达的调控作用,本文用rhBMP-6(200ng/ml)处理MDA-MB-231细胞,分别经0、3、12、24、48、72、96小时收集细胞总RNA,通过定量RT-PCR分析E-cadherin和δEF1在转录水平的表达变化。结果显示,rhBMP-6能够明显、快速地抑制δEF1转录(处理后<3小时开始变化),而相对较晚地促进E-cadherin转录(处理后>12小时开始变化),推测BMP-6通过抑制δEF1的转录而间接调控E-cadherin的表达。
为了证实上述假说,本文以人E-cadherin启动子(-308/+21)为模型,进一步探讨了MDA-MB-231细胞中BMP-6、δEF1对E-cadherin转录的调控关系。鉴于人E-cadherin启动子(-308/+21)上有2个E2-box即δEF1结合位点,分别为E-box 1(-80/-75)和E-box 3(-30/-25)。分别将野生型、E-box 1 Mut、E-box3 Mut.或E-box 1+3 Mut.的人E-cadherin启动子-荧光素酶报告基因质粒与pcDNA6B-δ-FL表达质粒共转染至MDA-MB-231细胞,24小时后用200ng/ml的rhBMP-6处理。通过荧光素酶活性分析发现,δEF1能够有效地抑制rhBMP-6诱导的野生型人E-cadherin启动子(-308/+21)的转录激活。单独将E-box 1或E-box 3突变,不能够阻断δEF1对E-cadherin启动子的转录抑制作用,只有将这2个δEF1结合位点同时突变才能使其丧失抑制作用。上述结果表明,δEF1对rhBMP-6诱导人E-cadherin启动子转录具有显著的抑制作用,单一的结合位点(E-box 1或E-box 3)就足以募集δEF1并介导这一作用。本文进一步证实了δEF1对E-cadherin启动子的转录调控具有剂量依赖性效应。分别将野生型、E-box 1Mut.、E-box 3 Mut.或E-box 1+3 Mut.的人E-cadherin启动子与不同为浓度的pcDNA6B-δ-F表达质粒(0、2.5、5、10μg/well)共转染至MDA-MB-231细胞,24小时后用200ng/ml的rhBMP-6处理。通过荧光素酶活性分析发现,δEF1转染的剂量越高,对rhBMP-6诱导人E-cadherin启动子转录的抑制作用越强。此外,同样用200ng/ml的rhBMP-6处理MDA-MB-231细胞,72小时后进行Q-CHIP分析,发现rhBMP-6诱导能够明显减弱内源性δEF1与E-cadherin启动子(-175/+21)的结合。上述结果充分说明δEF1是通过与E-cadherin启动子序列中特定的反应元件(E2-box)直接结合而实现转录抑制作用,BMP-6诱导能够弱化内源性δEF1与E-cadherin启动子的结合从而间接激活E-cadherin转录。另一方面,本文应用RNA干扰技术,从基因缺失角度证实了δEF1对rhBMP-6诱导人E-cadherin启动子转录的抑制作用。将δEF1反义寡核苷酸片段克隆至4.1-CMV载体构建siRNA-dEF1质粒。将野生型人E-cadherin启动子(-308/+21)与siRNA-dEF1质粒共转染至MDA-MB-231细胞,24小时后用200ng/ml的rhBMP-6处理。通过荧光素酶活性分析,发现在δEF1表达被阻断(蛋白表达水平下降>70％)的情况下,rhBMP-6对人E-eadherin启动子的转录激活作用明显增强。与未阻断对照组相比,荧光素酶活性升高近1.5倍。
本文通过体外研究初步证实在人乳腺癌细胞MDA-MB-231中：(1)δEF1对BMP-6诱导人E-cadherin启动子(-308/+21)转录具有显著的抑制作用；(2)δEF1通过与人E-cadherin启动子中的特定序列(E2-box)直接结合而实现这一转录抑制作用,单一的E2-box就足以募集并结合δEF1使之完成转录抑制功能。；(3)BMP-6诱导能够弱化δEF1与人E-cadherin启动子的结合从而间接激活E-cadherin的转录。综上所述,BMP-6是通过抑制δE目的转录间接诱导E-cadherin表达。
本文从BMP-6、δEF1、E-cadherin三者在乳腺癌细胞中的表达调控关系展开研究,初步阐明了在乳腺癌细胞中δEF1对BMP-6诱导的EMT和/或E-cadherin表达的转录抑制作用以及相关的分子机制,揭示了BMP-6、δEF1在乳腺癌发生、发展、转移特别是骨转移中所具有的潜在功能,为进一步阐明乳腺癌骨转移的分子机制提供新的线索。