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副猪嗜血杆菌病和猪链球菌病是目前危害全球养猪业的主要细菌性疾病,二者往往协同感染或混合感染,给养猪业造成了巨大的经济损失。目前,临床上防控猪链球菌病和副猪嗜血杆菌病主要依赖灭活疫苗或弱毒疫苗,其免疫保护力良好,但缺乏交叉保护力。所以,开发一种具有较高交叉免疫保护力且廉价的新型副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联疫苗迫在眉睫。传统的血清学分型方法常用于副猪嗜血杆菌和猪链球菌流行病学调查和临床诊断,但该传统方法存在耗时费工,且10%~40%的菌株无法定型等问题,给临床诊断及流行病学分析造成了一定的困难。针对现有方法的不足,本研究选取了副猪嗜血杆菌和猪链球菌各血清型荚膜多糖合成基因簇位点中基因的差异点,设计了血清型特异性引物,分别建立了副猪嗜血杆菌和猪链球菌的PCR定型方法,并利用此两种方法分别对临床分离的副猪嗜血杆菌和猪链球菌进行定型分析。结果表明,用副猪嗜血杆菌PCR定型方法和琼脂扩散方法分别对2007年~2015年间的298菌株进行血清型鉴定,PCR方法的定型率为94.3%(281/298),琼脂扩散法的定型率为76.51%(228/298),PCR分型方法分型率显著优于琼脂扩散方法;并且PCR分型结果表明临床中以血清型4型、5型和12型最为流行,分别占25.17%、23.15%和20.47%,其次为13型(6.04%)、2型(5.03%)、7型(3.69%)。用猪链球菌PCR定型方法对广东多个地区猪链球菌携带情况调查发现,不同阶段猪群均可携带猪链球菌,携带率为17.11%~100%不等。养殖场SS阳性率为48.35%,屠宰场为44.44%,而发病猪群可达85.53%,其中健康猪群以血清型29型(8.81%)、2型(8.55%)、11型(6.22%)、16(5.70%)型为主,而发病猪群以血清型2型(16.41%)、3型(9.23%)、7型(7.18%)和9型(6.15%)为主。对118家临床发病猪场统计发现,HPS感染场为68家(57.63%),SS感染场99家(83.90%),HPS和SS混合感染的场为51家,占43.22%。通过上述流行病学的调查,基本掌握了近期广东省副猪嗜血杆菌和猪链球菌的流行与分布情况,通过动物试验,从中筛选出疫苗候选菌株副猪嗜血杆菌H26株和猪链球菌S3株,H26对当前流行的4型、5型菌株具有交叉保护,保护率均达到100%;S3对2型、7型和9型菌株具有较好的交叉保护,保护率分别为80%、100%和100%。将H26和S3制备成3批副猪嗜血杆菌和猪链球菌二联灭活疫苗,经试验验证,3批疫苗单剂量接种、单剂量重复接种和超剂量接种均对10日龄仔猪有较好的安全性,接种仔猪注射部位无炎症反应,未引起仔猪食欲减退、精神沉郁、体温升高等;疫苗免疫效力试验显示,当副猪嗜血杆菌最小免疫剂量达到4×10~9 CFU/mL、猪链球菌最小免疫剂量达到2×10~9 CFU/mL时,该二联疫苗能够保护仔猪免受副猪嗜血杆菌和猪链球菌的攻击,3批疫苗的保护率均可达4/5以上,HPS抗体凝集效价均≥1:16。经验证疫苗的免疫持续期可达4个月,保存期可达到18个月。最终确定疫苗的最小免疫剂量为2 mL。与同类产品比较发现,该二联疫苗的免疫效力高于对照商品疫苗,有效解决了现有疫苗如副猪嗜血杆菌和猪链球菌的单苗,需要多次免疫,费时费力且免疫效果不理想等问题。