荧光寿命与荧光团所处的微环境密切相关,且不受激发光强度、荧光团浓度和光漂白等因素影响,能够提供与荧光光谱技术、荧光显微技术互补的生物体功能信息。荧光寿命测量系统一般是基于激光扫描共聚焦显微系统（LSCM）搭建的。LSCM的分辨率能够达到亚微米量级,是研究生物组织样品的重要工具,在生命科学、生物医学、工业检测等领域获得了广泛的应用。LSCM中的共焦小孔使得焦平面以外的荧光被屏蔽,只有焦点处的荧光才能被收集,从而具有三维光学成像能力。双光子激光扫描显微镜（TPLSM）结合了LSCM和双光子激发技术。双光子激发基于三阶非线性效应,只发生在物镜焦点处,无需共焦小孔即可三维成像,提高了荧光检测效率。除此之外,TPLSM还具有非侵入、成像深度深、成像质量高、适合观察活细胞等优点,是进行生物组织活体成像的重要工具。本论文主要搭建了具有双色LSCM成像模式和TPLSM成像模式的荧光显微系统,然后在双色LSCM成像模式下进行荧光寿命测量实验获得荧光蛋白e GFP和m Cherry的荧光强度衰减曲线,最后采用L-M算法、FFT算法和Prony算法进行荧光寿命拟合并获得相应的荧光寿命值。具体内容如下:（1）双色LSCM/TPLSM系统搭建。这一荧光显微成像系统主要包括:LSCM561nm激发光路、LSCM470nm激发光路、LSCM探测与寿命测量光路、TPLSM激发与成像光路,其中前三条光路组成了双色LSCM荧光寿命测量系统。在LSCM两条激发光路中重点解决了双色激发光斑重叠的问题以及光纤耦合效率过低的问题。在LSCM探测与寿命测量光路中设计了两种探测模式,一种是荧光强度探测模式;另一种是具有双通道的荧光寿命探测模式,可以同时观察样品中两个不同的荧光团。在TPLSM激发与成像光路中解决了激光分束等问题,将飞秒激发光引入光束调节单元,最终进入MPM200-2双通道多光子系统实现对样本的激发和荧光探测。（2）荧光寿命测量实验。利用搭建的荧光显微系统并在双色LSCM成像模式下进行荧光寿命测量实验,分别采用不同浓度的配体DKK1（e GFP标记）与细胞膜上的受体LRP6（m Cherry标记）结合,基于时间相关单光子计数法（TCSPC）获得e GFP和m Cherry的荧光强度衰减曲线。针对双色荧光寿命测量实验获得的荧光强度衰减曲线,分别采用L-M算法、FFT算法和Prony算法进行荧光寿命拟合,计算出e GFP和m Cherry的荧光寿命值。结果发现,三种算法拟合得到的e GFP和m Cherry荧光寿命基本一致,且与文献报道相符。拟合得到的不同配体浓度下e GFP荧光寿命值在1.9 ns上下波动,m Cherry荧光寿命在1.5 ns到1.6 ns之间。此外,e GFP荧光寿命均值随着配体浓度的升高而减小,m Cherry荧光寿命均值随着配体浓度的升高而小幅度增大。这是由于当选用不同浓度的配体DKK1（e GFP标记）与细胞膜上的受体LRP6（m Cherry标记）相结合时,细胞膜上的LRP6蛋白数量会减少,e GFP和m Cherry所处的微环境会发生变化,从而导致它们的荧光寿命改变。