乌头是毛茛科乌头属一年生或多年生草本植物,该属植物含有剧毒乌头碱,动物采食乌头中毒后主要表现为呕吐、腹泻、心脏骤停、瞳孔散大、呼吸衰竭、视觉和听觉减弱甚至丧失、肌肉强直、步态不稳等。乌头碱具有靶器官毒性,主要危害神经系统和心血管系统。国内外学者对乌头碱的毒性机制进行了深入而广泛的研究,主要集中在能量代谢、离子通道、氧化应激损伤等方面,而乌头碱致神经细胞凋亡及作用机制尚不清楚。细胞凋亡是一种由内在基因控制的、有序的主动死亡过程。细胞凋亡发生机制主要包括两种,线粒体/Cyto C介导的内源性细胞凋亡途径和死亡受体介导的外源性细胞凋亡途径。为了进一步明确细胞凋亡在乌头碱致神经细胞毒性损伤中的作用及其调控机制,本研究以正常小鼠海马神经细胞（HT22细胞）为体外试验模型,探讨乌头碱对HT22细胞凋亡的影响,明确乌头碱致HT22细胞凋亡的信号转导通路,揭示乌头碱致神经毒性的作用机制,以期为动物乌头中毒病防治研究提供理论参考。试验结果如下:1.乌头碱抑制HT22细胞生长并引起多巴胺释放用含乌头碱分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的培养液处理HT22细胞6 h和12 h,发现HT22细胞活性以时间-剂量依赖性降低,HT22细胞内多巴胺含量以剂量-依赖性升高,且组间差异显著（P＜0.05）。与对照组相比,不同剂量的乌头碱处理HT22细胞12 h后,HT22细胞数目减少且形态均发生显著改变,呈现明显剂量-效应关系。2.乌头碱诱导HT22细胞凋亡用含乌头碱分别为0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的培养液处理细胞12 h,结果显示,对照组细胞结构完整,胞核较大,染色质均匀分布于胞核内;而处理组HT22细胞膜碎裂,线粒体轻度肿胀,部分线粒体嵴断裂、消失,呈空泡状;细胞染色质不均匀分布,沿核膜聚集并浓缩成大小、形态各异的块状物,染色质裂解,呈碎片状;细胞核出现球状突起（凋亡小体）,其中包裹完整的细胞器,排列成新月体状、环状、碎块状,出现典型的凋亡变化。为了进一步明确乌头碱可以诱导HT22细胞发生凋亡,用流式细胞仪检测Annexin V-FITC/PI双重染色后细胞凋亡率的变化。结果显示,0μg/mL、50μg/mL、100μg/mL和200μg/mL的早期凋亡率分别为6 h分别为2.47%、3.53%、5.30%、12.5%,12 h分别为2.6%、6.8%、6.15%、6.78%;晚期凋亡率6 h分别为4.48%、6.43%、5.39%、5.27%,12 h分别为4.67%、8.18%、9.18%、10.6%;总凋亡率6 h分别为6.95%、9.96%、10.69%、17.77%,12 h分别为7.27%、14.98%、15.33%、17.38%,且组间差异显著（P＜0.05）。HT22细胞早期凋亡率随时间的延长逐渐下降,晚期凋亡率随时间的延长逐渐上升,总凋亡率呈时间-剂量依赖性增加,表明乌头碱可以诱导HT22细胞发生凋亡。3.乌头碱通过线粒体及死亡受体通路诱导HT22细胞凋亡为了明确乌头碱致HT22细胞凋亡的信号通路,我们采用MTT法测定存活率,应用双抗体夹心法测定Caspase3的含量,运用蛋白免疫测定Caspase3蛋白的表达。结果显示,加入Caspase8抑制剂Z-IETD-FMK和Caspase9抑制剂Z-LETD-FMK后,HT22细胞的存活率显著上升,Caspase3的活性显著下降,蛋白免疫印迹结果与前两者结果趋于一致,结果表明乌头碱可同时通过线粒体通路和死亡受体通路两种途径诱导HT22细胞凋亡。为了进一步验证乌头碱通过线粒体通路和死亡受体通路诱导HT22细胞凋亡,采用q RT-PCR和Western-blot检测HT22细胞凋亡相关基因及其蛋白的表达量。结果显示,凋亡相关基因和蛋白的表达量随着乌头碱浓度的上升发生明显改变,Bax、Cyto C、Apaf-1、Caspase9、Caspase3、Caspase8、Fas、Fas L、Fadd的基因及蛋白表达水平均显著上升（P＜0.05）,Bcl-2基因及蛋白表达水平均显著下降（P＜0.05）,Bid基因表达水平上升,而蛋白表达水平下降,且呈明显剂量依赖性。由上述试验结果可以看出,乌头碱可抑制HT22细胞生长并引起多巴胺释放,并诱导HT22细胞发生凋亡,而乌头碱诱导HT22细胞凋亡是线粒体通路和死亡受体通路共同参与调控的结果。