花粉壁不仅在花粉发育和受精过程中发挥重要作用,还和雄配子存活、雄性不育以及花粉识别等过程相关。自四分体形成之后,由小孢子和绒粘层控制的花粉壁的形成成了花粉发育中的主要事件。这一过程涉及一系列花粉壁合成生物分子的参与,受高度复杂的基因网络调控。深入认识花粉壁发育相关基因的功能及关键基因间的调控关系,将为充分理解植物有性生殖的分子机制,并利用其有效地调控育性,实现农作物高产、高效繁殖等提供理论依据和技术支持。本文以白菜(Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino, syn. B. rapa ssp. chinensis)‘矮脚黄’核雄性不育(’Aijiaohuang’genic male sterility, ajhGMS)两用系ajhGMS’Bcajh97-01A/B’为材料,对两个经典阿拉伯半乳糖蛋白(arabinogalactan proteins, AGPs)基因Brassica campestris Male Fertility8(BcMF8)和Brassica campestris Male Fertility18(BcMF18)与两个果胶甲酯酶(pectin methyl esterases, PMEs)基因Brassica campestris Male Fertility23a (BcMF23a)和Brassica campestris Male Fertility23b (BcMF23b)进行序列结构和表达分析,并采用反义RNA技术对BcMF8和BcMF18进行单基因抑制和双基因共抑制进行功能验证,继而采用形态学、分子生物学和细胞学的方法,研究它们在白菜花粉发育和花粉管生长过程中的作用机制。同时,利用过表达基因转化拟南芥(Arabidopsis thaliana),研究外源AGP基因BcMF18对花粉壁发育的影响。取得的主要结果与结论如下：(1)通过基因表达和功能分析,发现经典AGP基因BcMF8与花粉内壁发育、萌发沟形成和花粉管生长相关。对本实验室前期分离得到的在花发育后期小孢子中表达的BcMF8进行Real-time RT-PCR和组织原位杂交分析,发现BcMF8除在花粉中表达外,还是一个授粉后持续表达基因,在花粉管和授粉后柱头表面表达。原核表达分析结果显示BcMF8编码一个大小约为20kDa的水溶性蛋白。亚细胞定位结果显示BcMF8分布于细胞壁、质膜和胞外基质。采用反义RNA技术抑制BcMF8的表达,发现转反义BcMF8基因菜心植株结籽率降低,花粉形态异常、呈“拖鞋状”两侧向内坍塌,萌发沟分布异常,内壁在单核花粉晚期于正常的三个萌发沟区域外增厚,成熟花粉中萌发沟数目增加到四个；部分花粉不能正常萌发,且萌发的花粉管绝大多数不能正常生长；体内花粉管的萌发和生长受阻,但仅限于早期在花柱中生长,后期仍有部分花粉管顺利到达子房基部并完成双受精,但结籽率明显降低。这些结果都表明BcMF8参与花粉内壁形成和花粉管生长,在维持花粉壁和花粉管基质结构方面发挥着重要作用。(2)基因表达和功能分析结果表明BcMF18是一个与花粉内壁发育相关的经典AGP基因。采用同源克隆的方法,获得了AGP基因BcMF18的cDNA和DNA全长。核酸序列和推演的氨基酸序列分析结果表明其具有经典AGP基因的特征。通过半定量、Real-time RT-PCR和组织原位杂交分析,发现BcMF18的转录本最早在单核花粉期开始出现,随后在双核花粉期、成熟花粉期的花蕾及开放的花中持续表达,并仅限于花粉中检测到,表明BcMF18可以归为花粉发育“晚期”基因。原核表达分析结果显示BcMF18编码一个大小约为20kDa的水溶性蛋白。亚细胞定位结果显示BcMF18分布于细胞壁、质膜和胞外基质。过表达基因转化拟南芥植株角果短、结籽率降低,近50%的花粉皱缩、体积变小、不能正常萌发出花粉管,畸形花粉自双核时期出现异常,内壁建成后发生降解、纤维素不能正常沉积,进一步引发细胞核和内含物降解,只剩下含油层、外壁外层和外壁内层。采用反义RNA技术抑制BcMF18的表达,发现转反义植株角果变短、结籽率降低,近50%的花粉皱缩、体积变小、不能正常萌发出花粉管,畸形花粉自单核发育时期即开始出现异常,双核期的花粉不能正常形成内壁和沉积纤维素,且内含物和细胞核发生降解,最终形成的花粉只是外壁和含油层构成的空壳,不具细胞核和正常生活力。这些结果都表明,BcMF18可能通过影响纤维素沉积而影响花粉内壁发育。(3)通过基因表达和功能分析,发现BcMF8和BcMF18表达模式相似但不完全相同,在花粉发育过程中功能不重叠,在绒粘层程序性细胞死亡过程(programmed cell death, PCD)中功能冗余。BcMF8和BcMF18核苷酸序列相似性为52.3%,在氨基酸序列相似性为65.2%。Real-time RT-PCR分析结果表明BcMF8和BcMF18均具有花粉发育后期花粉特异表达的特征,在不同发育阶段的组织或器官中的表达变化趋势大体相近,都在单核花粉期左右的花蕾中开始有微弱表达,随着花发育的进行,表达量逐渐升高,但不完全相同。在同一组织或器官中,BcMF8的表达量要比BcMF18高,且只有BcMF8为授粉后持续表达基因。采用反义RNA技术同时抑制BcMF8和BcMF18的表达后,花粉畸形率比单个基因抑制后的高,但花粉缺陷并没有加剧,花粉综合呈现了两种分离表型：“拖鞋状”两侧向内坍塌的花粉,其内壁在预定的三个萌发沟区域外增厚,萌发沟数目增加；皱缩表型的花粉,纤维素不能沉积,内壁不能正常形成,花粉内含物和细胞核降解。单独抑制BcMF8或BcMF18的表达后,绒粘层发育异常,但两者同时受到抑制后,绒粘层却提前发生了降解,表明BcMF8和BcMF18在绒粘层PCD过程中发挥作用,且功能冗余。(4)通过基因表达分析,发现两个PME基因BcMF23a和BcMF23b均在花发育晚期花粉中表达,编码两个定位于质膜和细胞壁的分泌蛋白。采用同源克隆的方法,获得了拟南芥PME基因At5g07410在白菜中两个同源基因BcMF23a和BcMF23b的cDNA和DNA全长。核酸序列和推演的氨基酸序列分析表明两者均具有经典PME基因的特征,两者核苷酸序列相似性为86%,氨基酸序列相似性为89.3%。半定量、Real-time RT-PCR、组织原位杂交分析和启动子活性表达分析结果表明BcMF23a和BcMF23b在双核花粉时期开始于花粉中表达直至成熟花粉时期,开放花中检测不到表达,并仅限于花粉中；除花粉外,BcMF23b还在瓣膜基部、幼苗真叶基部离层及主侧根中的表达。原核表达分析结果显示BcMF23a和BcMF23b编码两个大小约为40kDa的水溶性蛋白。酶活检测发现在大肠杆菌(Escherichia coli)表达体系中诱导表达的BcMF23a具有PME活性,而BcMF23b检测不到PME活性。亚细胞定位结果显示BcMF23a和BcMF23b分布于细胞壁、质膜和胞外基质。