前言膀胱过度活动症(OAB)是一种以尿急为主要特征的症候群,通常伴有尿频和夜尿症状,伴或不伴有急迫性尿失禁,不包括由尿路感染或其他明确的病理改变所导致的症状。OAB对患者的生活质量产生严重的影响,并给个人及社会带来较大的心理负担和经济压力。OAB发病原因尚不清楚。目前OAB一线治疗方案包括行为治疗和药物治疗。抗胆碱能药物是目前治疗OAB最常用的药物,其疗效和安全性比较肯定,但口干、便秘、眩晕等副作用严重影响患者的依从性,治疗效果并不满意。神经电刺激主要是通过电刺激外周神经对膀胱和尿道的功能进行调控,当一线治疗失败后,可以考虑神经电刺激治疗。骶神经调控是临床上应用最早的神经电刺激治疗,目前骶神经调控和胫神经电刺激已经通过美国FDA认证并批准为治疗OAB的方法,AUA和EAU的指南均推荐神经电刺激治疗用于药物治疗失败的OAB患者。同时,最新的研究结果提示阴部神经电刺激也可以用来治疗OAB及急迫性尿失禁等。但是,神经电刺激的作用机理、作用部位、参与的神经递质以及激活的受体目前仍不明确。膀胱的储尿过程和排尿过程高度依赖于膀胱和尿道的肌肉的协同作用,这种协同作用主要是通过位于大脑、脑桥以及脊髓和外周神经节来进行调控的。正常生理情况下,有髓鞘的A δ传入纤维激活并传递膀胱内压力,经脊髓传递至脑桥,然后经过脊髓,将信息下传至膀胱,进而激发一种非伤害性的脊髓-脑-脊髓-膀胱长反射。而在泌尿系统的感染及其他刺激等引起的病理状态下,可以通过激活无髓鞘的C传入纤维,将信号传递至脊髓,激发脊髓-膀胱短反射。目前研究发现多种神经递质参与外周神经电刺激对膀胱活动的调控,我们课题组前期的研究结果发现,GABAA受体在阴部神经电刺激调控膀胱过度活动中发挥重要的作用,并且发挥作用的位置位于脊髓;而甘氨酸受体(Glycine)和阿片类受体(Opioid)只发挥很小或者不发挥作用。然而,前期关于阿片类受体和胫神经电刺激调控膀胱过度活动的研究发现,阿片类受体在胫神经调控中发挥重要的作用,在脑桥给予阿片类受体拮抗剂后可以消除胫神经电刺激的抑制作用,在急性胸髓横断(T8-9)横断后,PNS的抑制作用还在,而TNS抑制作用消失,说明阿片类受体参与调控胫神经电刺激抑制膀胱过度活动的过程,并且是在脊髓以上的位置进行调控。大麻素受体属于G蛋白偶联受体的一种,主要包括两个亚型:大麻素受体Ⅰ型和Ⅱ型,其中大麻素受体Ⅰ型主要分布在中枢神经系统,大麻素受体Ⅱ型主要分布在免疫系统。在排尿反射中,大麻素受体Ⅰ型和Ⅱ型主要分布于大鼠和人类的膀胱尿路上皮和神经内,同时大麻素受体和阿片类受体分享很多相似的药理机制,并且二者在中枢神经发挥相互协同作用。因为最新研究发现阴部神经传入纤维是经过骶1和骶2背根神经进入脊髓的,胫神经传入纤维经L7进入脊髓,另外,大麻素受体和阿片类受体在中枢神经系统的相互作用已经被证实。并且,我们课题组前期研究证明,通过猫膀胱内灌注乙酸,可以诱发膀胱过度活动,行膀胱压力容积测定,并联合外周神经电刺激,证明骶神经调控、胫神经电刺激、阴部神经电刺激均可以增加膀胱容量。因此,本研究主要包括以下两个部分:第一部分首先诱导猫0AB模型,然后行骶神经调控,通过静脉或鞘内注射GABAA受体拮抗剂印防己毒素(Picrotoxin),静脉注射甘氨酸(Glycine)受体拮抗剂士的宁,鞘内注射阿片类(Opioid)受体拮抗剂纳络酮等药物,分析膀胱容量变化,以此来研究GABAA,Glycine和Opioid受体在骶神经调控治疗膀胱过度活动中的作用及调控机制。第二部分诱导猫OAB模型后,电刺激胫神经和阴部神经联合大麻素受体Ⅰ型拮抗剂AM251(静脉注射或鞘内注射),分析膀胱容量变化,研究大麻素受体Ⅰ型在胫神经和阴部神经电刺激治疗膀胱过度活动中的作用及调控机制。第一部分:GABAA,Glycine和Opioid受体在骶神经调控治疗膀胱过度活动中的作用目的研究GABAA,Glycine和Opioid受体在骶神经调控治疗膀胱过度活动中的作用,以此来明确骶神经调控抑制膀胱过度活动症(0AB)的神经调节机制。方法1.手术过程本实验共用20只短耳猫,2-5%异氟烷吸入性麻醉成功后,进行气管插管保持气道通畅,右侧颈总动脉置管用以记录动脉血压,双侧头静脉置管用以实验过程中给予药物和静脉补液,将双侧输尿管游离,一侧结扎并剪断,另一侧连接橡胶管引流尿液,于尿道近端将双腔导管插入膀胱,一侧管腔与压力传感器相连接,用以监测膀胱压力(Cystometrogramm,CMG)的变化,另一侧管腔连接微量注射泵,用以灌注生理盐水或者0.5%乙酸(1-3ml/min),游离骶1和骶2神经,连接电刺激器。取5只猫,在脊髓棘突L3水平处做椎板切除术。首先将脊髓完整暴露,然后将硬脊膜打开,在蛛网膜下腔处将细导管(PE10)向尾侧方向插入,位置直至S1和S2水平,用做鞘内注射印防己毒素和纳络酮。在手术结束后静脉注射a-氯醛糖(初始剂量65 mg/kg,后2mg/kg/h维持剂量)和泮库溴铵(初始剂量0.1 mg/kg,后0.lmg/kg/h维持剂量),用以保持动物处于持续麻醉和肌肉松弛状态。然后对膀胱进行压力和容积测定以及骶神经电刺激研究。2、骶神经电刺激的参数选择根据我们前期的研究提示,单相矩形脉冲电流(5HZ,0.2ms)可以有效的抑制膀胱的过度活动,在实验开始后通过钩状电极刺激S1或者S2背根神经,当观察到出现明显的肛门括约肌或脚趾收缩的最小强度时,即为骶神经电刺激的阈值(Threshold,T)。测定阈值需在静脉注射泮库溴铵之前。3、实验过程及分组:实验起初,用生理盐水对每只猫进行膀胱灌注,当观察到出现时间超过20秒,幅度大于30cmH20的收缩波时的膀胱容量,即为猫的初始膀胱容量。在获得稳定的初始膀胱容量后,缓慢向膀胱中灌注0.5%的乙酸,激发C传入纤维活动,从而引起膀胱过度活动(OAB)。多次重复CMG,直至获得相对稳定的膀胱容量,此时的膀胱容量即为膀胱过度活动状态下的膀胱容量。待膀胱稳定后,进行骶神经刺激并观察其对膀胱过度活动症(OAB)的影响。重复以下4次CMG测定:(1)SNM 刺激前对照 CMG,(2)S1DRT 刺激的 CMG,(3)S2DRT 刺激的 CMG,(4)SNM刺激后对照CMG,记录不同状态下的膀胱容量,以检测骶神经刺激对0AB的影响及是否有刺激后效应。本实验共分为3组,第一组(N=9)给予累积剂量的GABA受体拮抗体印防己毒素(0.01,0.03,0.1,0.3和1.0 mmg/kg,i.v.).每次静脉给药后,等待10分钟,然后重复上述CMG。第二组(N=6)给予累积剂量的甘氨酸受体拮抗剂士的宁(0.001,0.003,0.01,0.03,0.1 和 0.3mg/kg,i.v.),在给予最后一个剂量的士的宁后,单次给予印防己毒素(0.3 mmg/kg,iv)。每次静脉给药后,等待10分钟,然后重复上述CMG。第三组(N=5)先给予鞘内注射印防己毒素(单一剂量0.4mg),然后给予鞘内注射阿片类受体拮抗剂纳络酮(单一剂量0.3mg),每次鞘内注射后,等待5分钟,然后重复上述CMG。每做完一次CMG,等待2-3分钟再进行下一个CMG,以保证膀胱彻底松弛。4、统计分析将实验动物每次测得膀胱容量与同一只猫的初始膀胱容量的比值(%),即为膀胱容量百分比,这是一标准化比值,有利于不同动物之间的数据进行统计分析。不同动物之间的统计结果采用平均值土标准误的方式表示。采用Student t检验进行两组间均数的对比,Bonferroni多重比较进行组内和组间的差异性检验。我们的统计分析结果,采用的是GraphPad Prism4统计软件,将P值小于0.05标记为具有统计学意义。结果1.S1或S2背根神经刺激明显抑制膀胱过度活动膀胱内灌注生理盐水测的初始膀胱容量标准化后值为100.2±0.59%,灌注0.5%乙酸后,膀胱容量明显降低至59.5±4.8%(P<0.01),表明乙酸成功激发C传入纤维,诱导膀胱过度活动。给予引起肛门括约肌收缩或者脚趾收缩的强度的骶1或骶2背根神经刺激,明显增加膀胱容量至105.3±9.2%和134.8±8.9%(P<0.01)。刺激后膀胱容量恢复至刺激前水平,提示无刺激后效应。2.静脉注射印防己毒素在骶神经调控抑制膀胱活动中的作用静脉注射印防己毒素在0.3-1.Omg/kg剂量时可以轻微的增加刺激前膀胱容量,但是这一增加没有统计学意义(P>0.05).在0.3mg/kg(P<0.05)剂量时可以明显阻断骶1背根神经刺激的抑制作用,但无法消除骶2背根神经刺激的抑制作用。但是,在1.Omg/kg(P<0.05)剂量时可以完全阻断骶1和骶2背根神经刺激的抑制作用.在刺激后,膀胱容量恢复至刺激前水平,提示无刺激后效应。3.联合静脉注射士的宁和印防己毒素对骶神经调控抑制膀胱过度活动的影响静脉注射士的宁在0.03-0.3mg/kg时可以显著增加刺激前膀胱容量,并且没有影响骶1和骶2背根神经刺激的抑制作用。在给予累积剂量0.3mg/kg 士的宁后,给予一次性剂量的印防己毒素(0.3mg/kg),可以明显增加刺激前膀胱的容量(P<0.05),同时消除了骶1和骶2背根神经刺激的抑制效应。然而,在没有士的宁的前期治疗下的相同剂量的印防己毒素(0.3mg/kg)只能消除骶1背根神经刺激的抑制效应,而对骶2背根神经刺激的抑制效应无作用。刺激后膀胱容量恢复至刺激前水平,表明无刺激后效应。4.鞘内注射印防己毒素和纳络酮对骶神经调控抑制膀胱过度活动的影响鞘内注射单一剂量印防己毒素(0.4mg)没有明显改变刺激前膀胱容量,并且没有影响骶1和骶2背根神经刺激的抑制作用。但是,骶神经刺激后膀胱容量明显增加(P<0.05),表明出现明显的刺激后效应。然后在此基础之上,给予单一剂量纳络酮(0.3mg),不仅显著降低了刺激前膀胱容量(P<0.05),而且消除了骶神经刺激后效应(P<0.05)。但是,即使我们鞘内注射了印防己毒素和纳络酮,骶1和骶2背根神经依然具有显著的抑制作用(P<0.05)。结论GABAA受体在骶神经调控膀胱过度活动中发挥重要的作用,并且在脊髓之上的位置发挥作用;甘氨酸受体的主要作用体现在兴奋GABAA受体的抑制作用;阿片类受体主要调控抑制脊髓GABAA受体后激发的刺激后效应。第二部分:大麻素受体Ⅰ型在胫神经和阴部神经电刺激治疗膀胱过度活动中的作用目的研究大麻素受体Ⅰ型在胫神经和阴部神经电刺激治疗膀胱过度活动中发挥的作用,以此明确胫神经和阴部神经调控膀胱过度活动症(0AB)的神经调节机制。方法1.手术过程本部分实验共应用17只短耳猫,2-5%异氟烷吸入性麻醉成功后,进行气管插管保持气道通畅,右侧颈总动脉置管用以记录动脉血压,双侧头静脉置管用以实验过程中给予药物和静脉补液,将双侧输尿管游离,一侧结扎并剪断,另一侧连接橡胶管引流尿液,于尿道近端将双腔导管插入膀胱,一侧管腔与压力传感器相连接,用以监测膀胱压力(Cystometrogram,CMG)的变化,另一侧管腔连接微量注射泵,用以灌注生理盐水或者0.5%乙酸(1-3ml/min),分离左侧胫神经和右侧阴部神经,袖套式电极包裹后连接刺激器。取5只猫,在脊髓棘突L3水平处做椎板切除术。首先将脊髓完整暴露,然后将硬脊膜打开,在蛛网膜下腔处将细导管(PE10)向尾侧方向插入,位置直至L7水平,用做鞘内注射AM 251。在手术结束后静脉注射a-氯醛糖(初始剂量65 mg/kg,后2mg/kg/h维持剂量)维持麻醉,对膀胱进行压力和容积测定以及胫神经和阴部神经电刺激研究。2、神经电刺激参数的选择根据我们前期的研究提示,单相矩形脉冲电流(5HZ,0.2ms)可以明显抑制膀胱的过度活动,通过袖套式电极对胫神经或阴部神经进行刺激,胫神经或阴部神经电刺激的阈值(Threshold,T)为观察到明显的脚趾或肛门括约肌收缩的最小强度。3、实验过程及分组:首先,多次测定膀胱容量,直至获得相对稳定的初始膀胱容量。然后,通过微量注射泵以1-3mml/min的速度向膀胱内灌注0.5%的乙酸,激活C传入纤维,从而诱导膀胱过度活动(OAB)。多次重复进行CMG测定,当获得相对稳定的膀胱容量时,将其定义为膀胱过度活动条件下的膀胱容量。待膀胱稳定后,进行胫神经电刺激(TNS)并观察其对膀胱过度活动症(OAB)的影响。重复以下4次CMG测定:(1)胫神经电刺激(TNS)前对照CMG,(2)胫神经电刺激强度为2T时即2T-TNS的CMG,(3)胫神经电刺激强度为4T时即4T-TNS的CMG,(4)胫神经电刺激(TNS)后对照CMG,记录不同状态下的膀胱容量,以检测胫神经电刺激对OAB的影响及是否有刺激后效应。阴部神经电刺激的操作过程同胫神经电刺激,即(1)刺激前对照 CMG,(2)2T-PNS,(3)4T-PNS,(4)刺激后对照 CMG本实验共分为4组,第一组(N=5),给予累积剂量的大麻素受体Ⅰ型拮抗剂 AM251(0.01,0.03,0.1,0.3 和 1.0 mg/kg,i.v.).给予完每个剂量的药物后,给予10分钟等待时间,然后进行上述胫神经电刺激CMG测定。由于AM251需要溶解在30%的聚氧乙烯蓖麻油(Cremophor),因此在第二组实验(N=5)中,给予与AM251相同的累积剂量的载体溶剂对照(0.01,0.03,0.1,0.3和1.0 mg/kg,i.v.30%的Cremophor溶解于生理盐水中),同第一组实验方案,给药后等待10分钟,然后重复上述胫神经电刺激CMG。第三组(N=5,其中三只动物取自载体溶剂对照组),给予鞘内注射AM251(单一剂量0.03mmg),给药后等待5分钟,然后重复上述胫神经电刺激CMG。第四组(N=5),给予累积剂量的大麻素受体Ⅰ型拮抗剂 AM251(0.01,0.03,0.1,0.3 和 1.0 mg/kg,i.v.).给予完每个剂量的药物后,给予10分钟的等待时间,然后进行上述阴部神经电刺激CMG测定。每做完一次CMG,等待2-3分钟再进行下一个CMG,以保证膀胱彻底松弛。4、统计分析将实验动物每次测得膀胱容量与同一只猫的初始膀胱容量的比值(%),即为膀胱容量百分比,这是一标准化比值,有利于不同动物之间的数据进行统计分析。不同动物之间的统计结果采用平均值土标准误的方式表示。采用Two-way ANOVA(Bonferroni)和 One-way AN0VA(Dunnett’ s)进行组间和组内的多重比较。我们的统计分析结果,采用的是GraphPad Prism4统计软件,将P值小于0.05标记为具有统计学意义。结果1.胫神经电刺激可以明显抑制膀胱的过度活动膀胱内灌注生理盐水测的初始膀胱容量标准化后值为100.1±0.27%,灌注0.5%乙酸后,膀胱容量明显降低至36.6±4.8%(P<0.01,N=12),表明乙酸成功激发C传入纤维,诱导膀胱过度活动。给予引起脚趾收缩的强度的2TTNS和4T TNS刺激后,明显增加膀胱容量至69.2±9.7%和79.5±7.2%(P<0.01)。刺激后膀胱容量恢复至刺激前水平,提示无刺激后效应。2.静脉注射AM251在胫神经和阴部神经电刺激抑制膀胱活动中的作用静脉注射AM251在降低胫神经电刺激抑制膀胱过度活动的同时并没有改变刺激前的膀胱容量。AM251分别在0.03mg/kg和0.1mg/kg时明显降低2T强度和4T强度的胫神经电刺激的抑制作用(P<0.05)。载体溶剂(30%的Cremophor溶解与盐水中)对照组对于胫神经电刺激的抑制作用以及刺激前的膀胱容量都没有作用。0.03mg AM251鞘内注射对胫神经电刺激的抑制作用以及刺激前的膀胱容量都没有作用,这一结果表明,药物的作用部位并不在第7腰椎。0.01-1.0mg/kg AM251静脉注射对于阴部神经电刺激的抑制作用以及刺激前的膀胱容量都没有作用。在本实验中,无论是注射药物或者载体溶剂都没有刺激后抑制效应的出现。结论大麻素受体Ⅰ型在胫神经电刺激抑制膀胱过度活动中发挥重要作用,并且发挥作用的部位位于脊髓之上。而在阴部神经电刺激调控膀胱过度活动中不发挥作用。