脓毒症(sepsis)是指由感染引起的全身炎症反应综合征，证实有细菌存在或存在高度可疑的感染灶。脓毒症诱发的休克、多器官功能障碍综合征等，是住院病人最常见的死因。全球每年有超过18万的严重脓毒症患者，且患者数目以每年1.5％的速度递增。　　 感染、创伤、缺血和严重损伤等都可以引发严重脓毒症，其特点是产生大量的促炎因子，如肿瘤坏死因子(TNF)、白介素(IL)-1和高迁移率族蛋白(HMGB)-1。大量的炎性细胞因子通过与其受体结合，激活信号转导通路，形成复杂的网络作用，最终导致过度的全身炎症反应和组织损伤。Janus激酶-信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)途径是近年发现的在细胞因子信号转导中起重要作用的信号通路。细胞因子信号转导抑制因子(SOCSs)是一族JAK/STAT途特异性内源抑制物，参与对JAK/STAT信号传递的“负反馈”调节过程维持机体的免疫自稳。本实验筛选了大鼠的SOCS-1基因，初步完成了该基因的原核克隆表达和部分生物学特性研究。在慢性蠕虫共感染的脓毒症模型中探讨该基因的免疫调控机制。　　 研究目的：　　 探讨大鼠细胞信号转导抑制因子-1的结构和特性。通过生物信息学分析方法对ratSOCS-1进行了结构分析及生物学功能的预测。　　 探讨大鼠细胞信号转导抑制因子-1的免疫学功能与定位。本研究通过构建该基因的原核表达系统，证实了该蛋白的免疫原性和免疫反应性。通过构建该基因的真核表达系统证实细胞水平的定位，并以该蛋白两个特征性表位为信号分子研究其拓扑学结构特征。　　 探讨华支睾吸虫感染的大鼠机体免疫应答的改变对CLP模型脓毒症的保护作用，并证明SOCS-1对信号通路的负向调节作用是可能的保护机制。　　 研究方法：　　 1、大鼠细胞信号转导抑制因子-1(ratSOCS-1)基因的多态性和的生物信息学分析　　 从大鼠基因组DNA扩增出ratSOCS-1两个不同的基因序列。应用在线核酸蛋白分析工具以及专门的生物信息学应用软件中相关程序(如：BLASTx程序、Translation程序和Alignx程序等等)对ratSOCS-1和其他物种的SOCS-1序列进行同源性比对，分析该蛋白的拓扑结构、抗原表位，功能域、分子进化关系以及蛋白质的三级结构，进而预测其生物学功能。　　 2、大鼠细胞信号转导抑制因子-1(ratSOCS-1)的免疫学研究　　 2.1 ratSOCS-1的原核克隆表达和重组蛋白的纯化和复性　　 从大鼠基因组DNA中扩增出ratSOCS-1基因。应用分子克隆技术构建ratSOCS-1的pET28a(+)原核表达质粒，在大肠杆菌中以包涵体形式表达。用6M尿素溶解包涵体，在变性条件下使用6his-binding亲和层析纯化重组蛋白，获得的变性纯化蛋白采用透析方法通过逐步降低尿素浓度进行复性，在尿素1M时改用PBS(pH7.4)透析，以去除尿素。　　 2.2 ratSOCS-1蛋白的免疫反应性鉴定　　 将获得的ratSOCS-1蛋白和外周血白细胞裂解的总蛋白，通过SDS-PAGE电泳和Western blotting方法，一抗应用获得的重组蛋白免疫兔血清(1∶800)观察免疫血清对重组蛋白和外周血白细胞中目的蛋白的识别能力。　　 3、大鼠细胞信号转导抑制因子-1(ratSOCS-1)亚细胞定位和核定位信号的鉴定　　 3.1 ratSOCS-1的真核克隆、表达和鉴定　　 从大鼠DNA文库中扩增出ratSOCS-1基因，并进一步扩增出敲除NLS的ratSOCS1-NLS/Del基因，应用分子克隆技术构建pEGFP-N1-ratSOCS-1和pEGFP-N1-ratSOCS1-NLS/Del真核表达质粒。　　 3.2 GFP-ratSOCS-1亚细胞定位　　 脂质体法将重组质粒转染HeLa细胞，用倒置荧光显微镜观察培养24h至72h蛋白的表达，比较其与对照载体pEGFP-N1表达的差异。以RT-PCR鉴定转染pEGFP-N1-ratSOCS-1和pEGFP-N1-ratSOCS1-NLS/Del质粒的HeLa细胞中的ratSOCS-1和ratSOCS1-NLS/Del基因在mRNA水平的表达。　　 4、大鼠细胞信号转导抑制因子(ratSOCS-1)拓扑结构研究　　 4.1 E18-25及E60-67表位克隆表达和纯化　　 合成E18-25及E60-67各自对应的正反两条DNA链，退火后获得酶切后的目的片段。将经分子克隆技术获得构建的pET28a(+)-hGST-E18-25及pET28a(+)hGST-E60-67重组质粒，进行原核表达，SDS-PAGE鉴定表达的重组蛋白，包涵体在变性条件下使用6his-binding亲和层析纯化重组蛋白。获得目的蛋白。　　 4.2 ratSOCS-1免疫血清对E18-25及E60-67的免疫反应性检测；E18-25及E60-67免疫IgY与ratSOCS-1的免疫反应性检测　　 分别将与E18-25、E60-67和ratSOCS-1免疫新西兰兔获得的免疫血清，以Westernblotting法检测ratSOCS-1免疫血清对E18-25和E60-67的识别；用免疫扩散的方法检测E18-25和E60-67的免疫IgY对ratSOCS-1蛋白的识别。　　 5、ratSOCS-1在华支睾吸虫感染对大鼠脓毒症保护作用的机制研究　　 健康SD大鼠50只，分为6组：①正常组(control)5只：正常SD大鼠，处死前常规饲养；②假手术组(sham)5只：仅行剖腹，不作结肠结扎及穿孔；③脓毒症模型组(CLP)10只：按文献方法行常规结肠结扎穿孔术建立脓毒症模型；④正常腹腔巨噬细胞过继转移后脓毒症模型组(CLP+Mφ)10只：过继转移正常SD大鼠腹腔巨噬细胞3天后行CLP术建立脓毒症模型；⑤肝吸虫慢性感染SD大鼠腹腔巨噬细胞过继转移后脓毒症模型组(CLP+Cs-Mφ)10只：过继转移肝吸虫慢性感染SD大鼠腹腔巨噬细胞3天后行CLP术建立脓毒症模型；⑥肝吸虫慢性感染后脓毒症组(Cs+CLP)10只：建立肝吸虫慢性感染模型后行CLP术建立脓毒症模型。各组在CLP术后24h、48h和72h记录死亡数，计算死亡率，并在麻醉满意后沿手术切口剪开腹腔，迅速取出肝脏、脾脏和肺脏，进行HE染色和组织病理学研究。取肺脏组织行SOCS-1免疫组化，检测SOCS-1蛋白的表达。　　 结论：　　 本研究显示大鼠的SOCS-1蛋白具有基因多态性，其重组蛋白具有免疫原性和免疫反应性，GFP蛋白示踪证实ratSOCS-1定位于细胞核内，证实了ratSOCS-1是核蛋白的预测。重组的ratSOCS-1免疫血清能特异性的识别hGST融合表达的E18-25和E60-67表位，并且GST融合表位的特异性IgY抗体也能识别ratSOCS-1，证实了生物信息学表位预测的正确性。　　 肝吸虫慢性感染所诱导的Th2免疫应答对CLP导致的脓毒症大鼠有100％的保护率，过继转移肝吸虫感染大鼠腹腔巨噬细胞也能使脓毒症大鼠的死亡率明显降低，脏器的病理损伤明显改善，两组SOCS-1免疫组化结果显示肺组织SOCS-1的表达量较单纯CLP组和正常巨噬细胞过继转移组降低。这些研究结果显示SOCS-1参与调节脓毒症大鼠的免疫反应，但在华支睾吸虫共感染的脓毒症动物模型中，SOCS-1可能只在病程早期参与免疫调节，而慢性蠕虫感染导致的免疫应答Th2极化使实验动物获得预适应，并且表现出对脓毒症的保护作用。