超低温保存技术是最有效、安全的长期保存种质资源的方法,但某些物种在超低温保存后出现存活率低或不能再生长的情况。目前,动物和人类细胞、组织的超低温保存研究已经证实超低温诱导的程序性细胞死亡(PCD)是造成存活率下降的关键原因之一,但在植物中,超低温保存诱导的PCD研究还很少。因此,从PCD方面来揭示植物超低温保存损伤机制,可为植物超低温保存技术优化提供新的思路和方法,对种质资源保存具有重要意义。本文以繁殖率高、细胞基因型一致,但超低温保存后再生困难的春石斛’红梦幻’(Dendrobium nobile Lindl.’Hamana Lake Dream’)的类原球茎(PLBs)为材料,研究了玻璃化超低温保存中PCD的发生情况,明确PCD发生的关键环节,在此基础上,探讨一氧化氮(NO)和过氧化氢(H202)作为信号分子在超低温保存诱导的PCD中的作用机制。其主要研究结果如下:(1)春石斛’红梦幻’ PLBs在玻璃化超低温保存程序中的玻璃化溶液(PVS2)处理和液氮冷冻-解冻环节发生了 PCD,具体表现在形态和生化两方面:①PLBs经PVS2处理后出现质壁分离、细胞核变形、胞内小囊泡形成、核仁解体和染色质浓缩等PCD特征,液氮冷冻-解冻加深了伤害,出现了自噬泡分解内含物、细胞器坍塌等PCD形态特征。②PCD关键执行酶caspase-3-like活性在PVS2处理和液氮冷冻-解冻这两个环节显著增加,促PCD基因Atg 8C和Rtnl B8,PCD防御基因Hkl 1和Hsp 70在液氮冷冻-解冻后高表达。(2)预培养是引起PCD的一个信号起始环节,PLBs在该环节没有表现出PCD形态特征,caspase-3-like活性增加不明显,但PCD相关调控基因却显著上调。超低温保存程序中液氮冷冻加快了 PCD进展,PCD相关调控基因在超低温保存后恢复培养的3 h内持续高表达,细胞结构在恢复培养3 h后表现出严重损伤,并开始出现DNA片段化,这可能是春石斛PLBs超低温保存后不能再生的主要原因之一。(3)春石斛’红梦幻’ PLBs玻璃化超低温保存预培养和装载(loading)环节产生的H2O2更多的是作为信号分子参与PCD发生:在玻璃化超低温保存预培养和装载环节添加H2O2抑制剂,显著降低了超低温保存后PLBs caspase-3-like活性,减轻了 PCD,提高了 PLBs冻后存活率。羟自由基(·OH)在春石斛’红梦幻’ PLBs玻璃化超低温保存中主要起氧化伤害作用。(4)NO在春石斛’红梦幻’ PLBs玻璃化超低温保存中主要起信号作用,且NO在预培养和loading环节对PCD的调控存在差异:在预培养环节施用外源NO抑制剂(50 μM cPTIO),抑制了超低温保存后PLBs部分促PCD基因的表达和caspase-3-like蛋白酶活性,减轻了超低温保存后PCD的发生,增加了 PLBs超低温保存后存活率,较对照组提高了 17.78%;在预培养环节施用外源NO供体(100 μM SNP),则促进了超低温保存后PCD发生,降低了 PLBs冻后存活率。而在loading环节添加外源NO供体(1 mMSNP),上调了超低温保存后的PCD防御基因,降低了超低温保存后PLBs的caspase-3-like活性,减轻了超低温保存后PCD的发生,增加了超低温保存后PLBs存活率,较对照组高了 18.44%;但在loading环节添加外源NO抑制剂(200 μM cPTIO),却对超低温保存后PLBs的存活率和PCD影响不明显。(5)预培养和loading环节的NO通过影响过氧化氢酶(CAT)和抗坏血酸-谷胱甘肽(AsA-GSH)循环活性,与H202相互作用,行使其信号功能,进而影响到超低温保存后PLBs的存活率和PCD发生;玻璃化超低温保存中去装载(unloading)环节NO的大量积累对超低温保存后PLBs的存活是不利的。(6)春石斛’红梦幻’ PLBs在玻璃化超低温保存的预培养环节有光抑制发生,在loading环节开始表现出光合机构受损,在unloading环节光合活性严重下降。超低温保存后的再生恢复培养并没有使PLBs受损的光合机构得到复原,光合活性的丧失可能发生在超低温保存后1h,较细胞结构上表现出的严重伤害提前。本研究的主要贡献在于:阐明了玻璃化超低温保存后春石斛PLBs存活率的下降与PCD有关;明确了 PVS2处理和液氮冷冻-解冻是PLBs玻璃化超低温保存程序中PCD发生的关键步骤;证实了预培养和loading环节的NO和H202作为信号分子参与了 PCD发生,与H202和AsA-GSH循环相互作用是NO可能的调控路径之一。