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目的和背景细胞内皮屏障是存在于血液和血管内皮之间具有限制性通透性的结构,对维护肾小球组织微环境的稳定具有重要意义。糖尿病早期内皮高通透性是糖尿病肾病、糖尿病视网膜疾病和糖尿病血管病变的重要发病机制。但内皮高通透性在糖尿病的启动机制远没有搞清楚,我们对它的干预的靶点仍然一筹莫展,因此,迫切需要探索新机制。Slit家族成员最初在中枢神经系统中被发现,为一种介导排斥信号机制的轴突导向分子。ROBO4主要在内皮细胞中表达,包括胚胎内皮和肿瘤血管内皮,并且在结构上不同于其他ROBO蛋白。ROBO4特异表达于血管内皮并且与其天然配体Slit-2结合。研究知道Slit2-ROBO4信号通路可通过抑制细胞因子介导的血管的新生和高渗透性来维持血管内皮的完整性。但糖尿病肾血管高通透性病变中ROBO4表达是否被改变仍然是未知的。ARF是属于Ras超家族的小GTP酶。ARF6主要定位于质膜和内体区,并且在质膜的内吞作用、胞吐作用、内体循环、细胞分裂和肌动蛋白细胞骨架重组中起重要作用。已知活化的ARF6可以通过破坏内皮粘附连接点诱导血管渗漏,Slit2-Robo4信号可通过阻断ARF6活性促进血管稳定性。而ROBO4能够激活下游信号分子GIT;后者是小分子GTP酶ARF6分子活性的抑制剂,也就是说,激活ROBO4后能抑制ARF6的功能,进而减缓血管新生和降低血管通透性。既然ROBO4具有降低血管细胞通透性的能力,因此我们假设可以通过阻断ARF6活性来抑制肾小球对高糖诱导的高渗透性。因此,我们研究了人肾小球内皮细胞中ROBO4和活化的ARF6蛋白的表达,以及ROBO4的过表达和阻断ARF6是否可以降低人肾小球内皮细胞在高糖条件下的高通透性。本课题分为3部分进行探讨第一部分:高糖对肾小球内皮细胞中ROBO4和活性ARF6蛋白表达及细胞通透性的影响。原代人肾小球内皮细胞(human renal glomerular endothelial cells,HRGEC)第2-5代细胞用于实验。以低糖(LG组)、高糖12h、高糖24h、高糖48h、高糖72h共5组细胞进行培养,GTP-ARF6 pull down获取活性ARF6,Western blot方法检测ROBO4、活性ARF6蛋白水平变化。利用Transwell系统培养HRGEC单层细胞,并使用异硫氰酸荧光素右旋糖酐(FITC-Dextran)检测细胞通透性,选取最佳时相点作为ROBO4基因过表达干预点。第二部分:过表达ROBO4对高糖诱导HRGECs活性ARF6蛋白表达及细胞通透性的影响。慢病毒包装ROBO4过表达基因转染HRGEC,然后将细胞分为低糖(LG组)对照组、高糖对照组、高糖慢病毒空载体组和高糖慢病毒介导的ROBO4过表达转染组4组,首先行CCK8观察慢病毒过表达是否对细胞存活率存在影响,GTP-ARF6 pull down获取活性ARF6,接着Western blot方法检测ROBO4、活性ARF6蛋白水平变化。利用Transwell系统培养HRGEC单层细胞,并使用异硫氰酸荧光素右旋糖酐(FITC-Dextran)检测过表达后细胞通透性的改变。第三部分SecinH3阻断ARF6活化对高糖诱导的HRGECs中ROBO4/ARF6蛋白表达及通透性的影响将SecinH3溶于有机溶剂DMSO中,并配置相应实验浓度,5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L。将HRGEC进行传代培养后分为低糖(LG组)对照组、高糖对照组、高糖+DMSO组、高糖+SecinH3 5μmol/L组、高糖+SecinH3 10μmol/L组、高糖+SecinH320μmol/L组共6组,GTP-ARF6 pull down获取活性ARF6,接着Western blot方法检测ROBO4、活性ARF6蛋白水平变化。利用Transwell系统培养HRGEC单层细胞,并使用异硫氰酸荧光素右旋糖酐(FITC-Dextran)检测过表达后细胞通透性的改变。结果第一部分:高糖刺激HRGEC 12 h内ROBO4表达明显增加,但24h出现回落,48 h和72h小时细胞ROBO4表达低于低糖组水平。而活性ARF6蛋白随高糖作用时间延长逐渐增高,72 h达最高。高糖增加培养HRGEC通透性,24h后血管通透性逐渐升高,72h达到最大值。第二部分:过表达的ROBO4可抑制高糖诱导的HRGEC ARF6增加;过表达的ROBO4可显著抑制高糖诱导的HRGEC通透性增加,恢复内皮细胞的通透性到正常组水平。第三部分:SecinH3可浓度依赖性减少高糖诱导的HRGEC ARF6活性水平增加。SecinH3可浓度依赖性减少高糖诱导的HRGEC通透性增加。结论高糖可时间依赖性增加HRGEC通透性,该作用可能与高糖降低HRGEC ROBO4蛋白表达和增加ARF6活性作用有关。过表达的ROBO4可显著抑制高糖诱导的HRGEC通透性增加,恢复内皮细胞的通透性到正常组水平,该作用可能与过表达的ROBO4抑制高糖诱导的活性ARF6蛋白增加有关。SecinH3可浓度依赖性减少高糖诱导的HRGEC通透性增加,机制与其减少高糖诱导的活性ARF6蛋白水平增加并上调ROBO4的表达有关。我们的研究推断恢复或上调ROBO4表达和抑制ARF6活性可能是将来糖尿病肾小球高渗透性的治疗新策略。