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斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus)亦称美洲鲶、沟鲶,为美国最重要的淡水养殖品种,其产量超过当前美国淡水水产总产量的一半以上。近年来的研究表明,真核生物体内广泛存在着一类与转录后基因沉默相关的重要RNA (microRNA,简称miRNA), miRNA参与了包括个体时序性发育、细胞增殖、分化、凋亡、激素分泌以及器官发育等在内的几乎所有已知的生物学过程。因此,我们推测miRNA在斑点叉尾鮰生长发育、免疫调节等生理过程中同样发挥了重要的基因表达调控功能。目前,针对斑点叉尾鮰这一物种,国内外已从功能基因克隆、分子标记开发、连锁图谱构建等方面开展了广泛的研究。但是,在本研究开始之前,国内外尚未见斑点叉尾鮰miRNA鉴定及其生物学功能的相关研究报道。在这种情况下,本研究在国内外率先开展了斑点叉尾鮰miRNA的系统鉴定工作,初步研究了部分miRNA的生物学功能。充分利用当前各数据库中已存在的基因数据,采用生物信息学方法预测miRNA,并结合分子生物学等方法对其进行验证是当前发现和鉴定miRNA的重要策略之一。在斑点叉尾鮰全基因组测序工作尚未完成的情况下,本研究利用目前所有已知鱼类的miRNA序列对斑点叉尾鮰EST和GSS数据库进行同源搜索。结合miRNA前体二级结构分析,从354483个ESTs以及63402个GSS序列中共预测到16个miRNA序列,其中3对miRNA分别位于同一 miRNA前体的两臂之上——分别为 ipu-miR-9-3p/5p、ipu-miR-126-3p/5p 以及 ipu-miR-142-3p/5p。选择斑点叉尾鮰肌肉、脾、头肾等5个组织对预测到的miRNA进行生物学验证,除ipu-miR-9-3p外,其它miRNA在所选择的斑点叉尾鮰组织中均有表达。对16个新预测到的miRNA进行靶基因预测,共预测到75个靶基因,其功能涉及基础代谢、生长发育、免疫调控以及胁迫响应等多个方面。考虑到同源搜索等生物信息学方法主要基于miRNA进化的保守性,不能发现非保守性或物种特异性的miRNA序列。本研究构建了含有斑点叉尾鮰肌肉、肝、脾等10个组织混合样品的小RNA文库,采用Solexa深度测序技术系统开展斑点叉尾鮰miRNA鉴定研究。对Solexa测序所获得的原始数据进行统计分析,共计获得了 14,919,026 个 Raw reads,这些序列代表了 161,288 个 Unique reads。将注释后去除rRNA、scRNA等序列后的小RNA定位到斑马鱼基因组上,分析其在斑马鱼基因组上的分布情况,同时筛选潜在的miRNA基因位点。共计有4,542,396个序列(代表了 25,538 Unique sequences)被定位到斑马鱼的基因组上。通过后续的生物信息学分析,共获得了 237个保守性miRNA序列(与miRbasel 8.0数据库中已有序列之间不多于1个碱基差异),属105个miRNA家族。同时,将不能比对上保守性miRNA的小RNA序列与斑马鱼基因组数据以及斑点叉尾鮰EST、GSS数据进行比对,结合miRNA前体二级结构分析,共计鉴定出45个新miRNA序列。在获得大量斑点叉尾鮰miRNA的基础上,本研究分析了新发现miRNA在斑点叉尾鮰肌肉、肝、脾等10个组织中的表达特征,同时研究了新发现miRNA在斑点叉尾鮰胚胎发育过程中的表达模式。组织表达分析结果表明,某些miRNA表现出一定的组织普遍性表达特征,如ipu-miR-129b,ipu-miR-7562以及ipu-miR-7553在所有10个组织中均具有较高的表达水平。此外,研究中发现某些miRNA具有一定的组织表达特异性——如ipu-miR-7575在斑点叉尾鮰胃中表达较高,ipu-miR-7147和ipu-miR-203c在斑点叉尾鮰心脏中表达较高。基因表达聚类分析结果显示,斑点叉尾鮰皮肤及肠组织(鱼类抵抗外来病原微生物感染的第一道屏障)中的miRNA表达特征比较相似——除ipu-miR-7556、ipu-miR-7562、ipu-miR-7553以及ipu-miR-129b等4个miRNA外,多数miRNA在这两个组织中表达量较低。为了获取新发现miRNA在斑点叉尾鮰胚胎发育过程中的表达特征,我们选择斑点叉尾鮰11个胚胎发育时期的样本进行miRNA表达分析,发现有23个miRNA存在显著的时期表达差异(P < 0.05)。这些miRNA多数在胚盘形成期(1细胞期)、体节出现期以及出膜前期表达较高,在斑点叉尾鮰卵裂期的表达水平较低,推测这种miRNA表达模式可能与其参与胚胎发育过程中相关靶基因的表达调控功能有关。对新发现的斑点叉尾鮰miRNA进行靶基因预测,45个miRNA共预测到281个靶基因,其生物学功能涉及细胞分裂、细胞分化以及器官发育等多个方面。肝脏是鱼类体内最主要的代谢器官及最大的消化腺,在鱼类消化、代谢、解毒以及免疫等在内的一系列生理过程中发挥着重要的作用。本研究以新克隆得到的斑点叉尾鮰45个新miRNA为目标,研究了感染嗜水气单胞菌后斑点叉尾鮰肝组织中miRNA的表达模式,探讨了miRNA在斑点叉尾鮰感染嗜水气单胞菌过程中的基因表达调控功能。结果表明,感染嗜水气单胞菌以后,斑点叉尾鮰肝组织中的miRNA表达模式大致可以分为2类。第一类由ipu-miR-7147、ipu-miR-7547等23个miRNA组成,这些miRNA在攻毒嗜水气单胞菌后2h表达上升,攻毒后8h、24h以及48h多数miRNA表达下调,其中有65.22%的miRNA至少在一个时间点表现出表达量显著性下调(P < 0.05)。另外一类由ipu-miR-7558a、ipu-miR-7566等22个miRNA构成。这些miRNA在攻毒嗜水气单胞菌后2h～24h期间多数表达上调,其中ipu-miR-24b、ipu-miR-7550以及ipu-miR-7567等3个miRNA至少在一个时间点表现为显著性提高(P<0.05);攻毒后48h,多数miRNA的表达量显著下调,其中ipu-miR-7568和ipu-miR-7575等miRNA的表达量表现为极显著性降低(P<0.01)。总体而言,攻毒后2h表达上调的miRNA数量较多,攻毒后24h以及48h则有更多的miRNA表达下调。对表现出显著性差异表达的miRNA进行靶基因生物学功能分析,其功能涉及斑点叉尾鮰免疫调控、胁迫应激、基础代谢以及转录因子调控等多个方面。生物信息学预测结果显示,斑点叉尾鮰微管相关蛋白基因RP/EB家族EB1基因的3,-UTR区具有ipu-miR-143的潜在作用位点。通过分析几种代表动物中微管相关蛋白基因RP/EB家族EB1基因和miR-143的进化保守性,推测ipu-miR-143在斑点叉尾鮰中可以通过靶向EB1基因的3’-UTR区而发挥其调控功能。因此,本研究将斑点叉尾鮰EB1基因的3’-UTR区(含有miR-143靶位点)构建到pMIR-REPORTTM Luciferase载体的下游,通过双荧光素酶报告基因检测系统对ipu-miR-143的靶基因进行鉴定。采用HEK293和CCK两种细胞进行细胞转染,两种细胞中转染miR-143 mimics组荧光相对活性与对照组相比均表现为显著性降低(P<0.05)。共转染miR-143 inhibitors后,CCK细胞中荧光素酶相对活性(8.27土 1.02)与对照组相比(5.44±1.51)显著上调(P<0.05); HEK293细胞中荧光素酶相对活性(6.29±1.19)与对照组(4.26±0.84)相比有所上升,但是无显著性差异(P=0.064)。初步研究结果提示,miR-143可以通过靶向EB1基因的3’-UTR区而发挥其调控功能,本研究为后续深入研究斑点叉尾鮰EB1基因的转录后调控机制积累了资料。总之,本研究在国内外率先开展了斑点叉尾鮰miRNA的克隆鉴定研究,获取了较多数量的斑点叉尾鮰miRNA序列,并初步研究了部分miRNA的生物学功能。本研究为后期深入开展miRNA在斑点叉尾鮰生长发育、免疫调节等生命活动中的调控机制研究积累了数据。