论文部分内容阅读
猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）是圆环病毒科圆环病毒属成员，分为Ⅰ型（PCV1）和Ⅱ型（PCV2）两个型，其基因组为共价闭合环状的单链DNA，大小约1.7kb，其中猪Ⅱ型圆环病毒（porcine circovirus 2，PCV2）是断奶仔猪多系统衰竭综合（postweaning multisystemicwasting syndrome，PMWS）的主要病原，它不但可引起断奶仔猪发生衰竭、死亡，还与仔猪先天性震颤（congential tremor，CT）、怀孕母猪流产（reproductive failure）、成年猪皮炎肾炎综合征（porcine dermatitis and nephropathy syndrome，PDNS）和呼吸道疾病综合征（porcinerespiratory disease syndrome，PRDS）有关。这些疾病的广泛流行严重影响养猪业，给很多国家和地区带来巨大的损失，更为严重的是PCV2的感染可以造成免疫抑制，引起其他各种病原的继发感染，造成的间接损失难以估计。PCV2已经成为严重阻碍养猪业发展的主要病原之一。因此，对本病毒的研究也逐步深入。我国是养猪大国，对该病及其病原进行研究更具有重要的意义本论文的实验由两部分构成：1，猪圆环病毒Ⅱ型OPE1和ORF2基因的克隆与表达。根据GenBank猪圆环病毒2型基因序列，设计合成两对特异性引物，对厦门株-1进行PCR扩增，得到ORF1和ORF2基因。将PCR产物酶切后，插入到pET-22b载体中，构建原核表达载体pET-22b／ORF1、pET-22b／ORF2，转化大肠杆菌BL21（DE3），经IPTG诱导表达，收集菌液进行SDS-PAGE分析。确定重组蛋白主要以包涵体的形式表达，包涵体洗涤溶解后，采用Ni2+离子金属螯合亲和层析柱纯化蛋白，逐步透析法进行复性，ELISA实验证明Rep蛋白和Cap蛋白均能与PCV2阳性血清发生特异性反应。2，猪圆环病毒Ⅱ型TaqMan荧光定量PCR检测方法的建立与初步应用参照GenBank收录的猪圆环病毒Ⅱ型（PCV2）基因组全序列选择保守区域设计合成了引物及其探针，并对其进行了筛选；对荧光定量PCR的反应条件进行了优化，建立了TaqMan荧光定量PCR检测方法。用建立的检测方法对临床采集的组织病料进行了检测，并与常规PCR作对比。结果显示，所建立的方法灵敏度可达3.0×101拷贝／μL，比常规PCR灵敏度高10倍，而与PCV1、CSFV、PRRSV和PRV没有交反应，具有灵敏度高、特异性强、操作简便等优点，适合于PCV2的流行病学调查和临床诊断。